ELISA——标准曲线篇

奋斗的小鸟

你在科室的角色是哪个？
老板？博后？博士？小硕？


你的科研四大愿望是否实现了？
文章发掉、课题结掉、基金申到、职称拿到


要是还没有的话，我们可以在实验上助您上"王者"！
Q：我的ELISA检测正常吗?
A：这是一个比较棘手的问题。当标准浓度下降时，信号是否减少？
如果答案是肯定的，那就是一个好的开始。如果答案是否定的，可能在某些步骤引入了一些背景，或者移液管可能需要校准。
Q：我是否可以改变标准品的配制？
A：不建议配制。我们江莱生物试剂盒内的标准品，都是已经配制好的。收到之后可以直接设置标准品孔，做标曲。
Q：我的ELISA实验有效吗?
A：是否可以看到标准品的信号？如果可以，实验是好的；如果没有，就应该进行故障排除。也许抗体问题，或者系统中的其他东西没有得到优化。
Q：洗涤方式怎样影响我的标准曲线？
A：不完全的洗涤会降低测定精确性，导致不理想的标准曲线结果。确保洗板机的正常工作，确保酶标板各孔被充分洗涤却不干燥。
洗涤方式可阅读：干货 | 洗板——直接影响ELISA结果！
Q：移液方式怎样影响我的标准曲线？
A：不合理的移液操作会导致高CV值和不理想曲线。在制作标准曲线的过程中，不正确的移液方式会导致错误的稀释，从而使错误的数值进入标准曲线中，或者产生非线性曲线。确保移液器正常工作。
每孔中的液体体积不等可能就是移液器失灵或者枪头使用不当所致。
Q：测定多个酶标板时是否可以使用同一条标准曲线？
A：在测定不同板中的样品时，每一个板都对应一条标准曲线。
技术错误或者不同的孵育情况，环境条件都会引起酶标板之间产生不同结果。一条标准曲线测定的样品值必需是在相同环境下产生的，否则就是无效值。
Q：我的标准曲线是平的或者是非线性的，这可能是由于什么原因引起的？
A：引起不理想的标准曲线的原因有很多，最常见的原因例举如下：
◆ 确定稀释是否得当。
◆ 确定波长是否正确。
◆ 标准品和样品必需在15-20分钟内滴加入板内。（除非试剂盒内说明书特别说明）
◆ 检查背景是否过高。
◆ 确定酶标板是否正确洗涤。不恰当的洗涤可能会引起具有高背景的平直曲线。
◆ 在测定过程中重复读板。在超过建议时间后读板会导致错误的结果。
◆ 如果最高的标准品的读数超过了酶标仪的范围，确定标准品是否正确溶解，孵育时间和温度是否准确。
◆ 为保证实验准确性请重复测定。
◆ 如果使用对照，对照的浓度必须在测定范围内。
◆ 在检测和孵育过程中确定试剂没有被污染。
◆ 没有任何信号的平直标准曲线可能是由于酶结合物或者底物没有反应。检查各个操作过程。
◆ 由于许多酶标仪的限制，因此建议标准品检测由高向低做复孔。
Q：是否在系统中引入了背景?
A：一组适当的标准品总是以空白结束，在空白孔中不存在标准品。如果空白孔OD值为>0.1，说明可能引入了一些背景。
计算未知数
标准曲线的真正能量在于它能够测定未知样品的浓度。如果我们观察IgG反应，我们可以将样本的OD值与标准的OD值进行比较，并根据相对OD值得出一些结论。
例如，如果我们知道一个333 ng/mL的标准品OD值在2.1左右，而一个111 ng/mL的标准OD值在1.7左右，那么我们可以假设一个未知的OD值在1.9左右应该在200 ng/mL左右。
直到我们把它画在曲线上，然后得出一个方程。当我们检测到更多的目标时，OD值上升，当我们检测到更少的目标时，OD值下降。


那么，曲线一定是线性的吗？这看起来不太对。坦白地说，这和我们的眼睛告诉我们的并不相符。
如果我们有1200ng /mL的浓度，OD值会是3吗?当然不是。数据看起来接近一条水平渐近线——曲线不会通过这个值。
所以不管浓度有多高，都不会超过2.5左右。类似地，这条曲线似乎表明，如果浓度为负，可以生成OD值在0.5左右。
Q：参数对数曲线
A：使用下图的数据来拟合，得到如下s曲线。这条曲线非常清楚地显示了水平渐近线，同时也显示了标准浓度增加或减少时的良好的、与剂量相关的响应。


四参数方程的拟合函数表达式为：


在这个方程中，“a”和“d”分别表示可以得到的最小值和最大值——我们的渐近线。“c”表示拐点——曲线的中点，“b”表示曲线在“c”处的斜率。
根据这个方程，我们现在可以反算出一个样本的未知浓度。大多数ELISA阅读器都可以自动完成这项工作。
它不仅限于竞争法, 夹心法也可以用它。它的形状, 根据情况, 可能是一个单调上升的类似指数, 对数, 或双曲线的曲线, 也可能是一个单调下降的上述曲线, 还可以是一条 S 形曲线。
它要求 X 值不能小于 0 (因为指数是实数, 故有此要求)。在很多情况下它都可以拟合 ELISA 的反应曲线, 所以它也成了 ELISA 中应用最广的模型之一。
当使用4参数拟合曲线时，记住一些实用的技巧是有帮助的。
由于以渐近线开始和结束，曲线范围之外的数据可能会产生不准确的结果。更进一步说，试着在S中间标准曲线的线性范围内工作。
一般来说，未知计算在曲线的线性范围内更准确。可以稀释超出标准曲线范围的样本，根据标准曲线计算浓度，然后根据初始稀释值乘以相应倍数。
Q：做标准曲线需要注意什么？
A：◆样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。
◆设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度zui陡段，即曲线几乎成直线的范围内。
◆最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。
◆检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。
◆标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。
◆做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999。
需要制作标曲软件→四步！轻松搞定 ELISA标准曲线制作与数据计算


<hr/>  文章来源于江莱生物（shjianglai666）

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/550093390