5.2.2 FACS & FC 流式

风云 · 发表于 2024-9-23 18:19

登陆有奖并可浏览互动！

您需要登录才可以下载或查看，没有账号？立即注册

×

目的
细胞和其它小型颗粒结构（如病毒[1]、外泌体[2]）的定量特性分析和分选。可以被计量的特性包括但不限于：

体积
复杂程度
DNA（细胞周期）
细胞表面和内部的蛋白质抗原
自表达荧光蛋白
细胞凋亡/活性

原理

免疫荧光和组化染色针对的是固定的2D或3D细胞与组织结构，而细胞流式本质上就是把这个过程转移到细胞悬液上。“流”之一字，指的是悬浮在液滴中的单细胞被观察和选择的载体和过程。
流式细胞仪（flow cytometer）的结构以后再说，对于大部分人不是很重要的知识。
操作

以细胞流式为例（其它小型颗粒可参考相关文献）：

制作细胞悬液。
在FACS染色缓冲液中重悬后对细胞数量进行计数。
使用Fc receptor抗体阻断非特异互动，血细胞尤其需要这一点。对于其它细胞种类，不确定的话还是不要省略这一步，以防万一。
分组（考虑到反复离心重悬丢掉的细胞加流式鲁棒性每组至少0.5mil，最多单管不超过10mil），具体要的对照组请看问题总结：
- 染色组；
- 无染色对照组No staining control（NSC）：在这一步之后不经过任何抗体处理的阴性对照组；
- 同型抗体对照组Isotype control：使用没有特异目标（如普通mouse IgG1）或特异目标不表达的同型一抗的抗体非特异互动对照组；
- 荧光扣除对照组Fluorescence minus one （FMO） control：多色实验时去掉其中一组荧光通道抗体的通道渗漏背景对照组，有些时候需要和流式细胞仪的背景补偿compensation功能共同使用。
如果有在细胞表面的目标抗原，优先进行细胞表面的一抗染色（one-step conjugated primary或two-step primary and secondary）。
如果需要固定细胞，一定要在表面抗原染色结束后进行。避免固定影响一抗结合。
如果有在细胞内部的目标抗原，固定后使用通透剂。重复染色步骤。
将处理后的细胞悬液通过0.45um单细胞筛。
上机分析，具体的机器使用方法以自家模型为准。

实验设计时要提前考虑的问题总结

分离试剂的种类：常用的分离试剂从强到弱包括0.25%trypsin（胰酶）+EDTA、TRYPLE、0.5mM EDTA、Accutase。对于分离试剂种类的选择主要是从分离强度和目标抗原种类两方面考虑：
- 对于神经元等比较脆弱的细胞，建议使用新鲜Accutase在37度培养不大于15分钟，配合少量机械解离；StemCell Technologies以及少量发表文献[3][4]中有提到Accutase最长可以培养45分钟以达到完全分离，但是我们FACS的manager非常不支持这种做法，因为这期间没有任何支撑细胞活性的东西，还不如强试剂短时间。
- 分离试剂的工作原理是蛋白酶（所有trypsin衍生产品）和/或抽取钙离子（EDTA），但是并不能排除这两者对其它细胞表面蛋白质的影响，尤其是胰酶。对于FACS荧光信号的影响几乎没有规律可言，相关文献基本上都是一个一个试出来的[5][6]；但是现象本身是存在的，必须要考虑在内。
FACS染色缓冲液的配方：可以买，也可以自己做。除了价格的问题以外，最大的不同之处在于自己做可以灵活改变成分比例：
- 2-10%（常见5%）FBS既为blocking agent同时也维持细胞活性。
- 0.5mM-5mM EDTA保持悬液单细胞分离状态，对于神经细胞等比较黏糊的细胞建议保持至少2mM。
- 2mM NaN3 叠氮化钠是防腐剂，对于固定细胞样本和胞内/核内蛋白FACS可添加；对于活细胞表面抗原酌情添加，尤其是需要分选后需要持续培养的细胞会因为细胞膜被叠氮化钠固定而影响膜活性和反应（长期培养恢复时间未知），对于神经细胞等有膜电位相关研究的细胞能省则省。而且所有商业抗体里都存在叠氮化钠，所以对于敏感种类细胞尽量减少接触。
细胞的数量：FACS的一大优势就是单细胞分析可以做到少样本高通量，但这并不代表带着10个细胞去也能做出好结果。操作中提到的0.5mil底线是综合里以下考虑：
- 离心重悬丢失的细胞数量：FACS染色一般在专用的5ml FACS玻璃管、Lo-Bind Eppenorf tube和96孔无黏附剂平板中进行。虽然这些媒介都有一定的防粘附考量，但即便如此染色后一般还是会丢至少10%；对于粘附性强和通透剂处理后的细胞种类，有时甚至会直接减少两个量级（也就是说上机前就剩1%）。
- 流式仪鲁棒性：实际上机操作时为了确定各通道电压voltage和圈门gating会先跑几遍样本，不能等实际录数据的时候细胞已经跑完了。
- 分选细胞丢失：我个人体验是10%阳性信号分选后只能也只能收获1%细胞，这个要综合流式仪算法、荧光信号强度和细胞活性，反正丢很多是肯定的。
- 少见event的power calculation：发表中其实很少考虑这件事，但是博士论文中可能会被问起。大概就是你需要多少细胞才能证明一个极少见的信号是真的，详见[7]。
对照组和抗体效果分析：
- 每次做实验一定要带：
  - 染色组 VS 无染色对照组：确定圈门用的阳性和阴性组。
- 使用新抗体和新细胞种类时必须测量但确定模版后不用每次都带：
  - 同型抗体对照组Isotype control：同型抗体对照对与活细胞表面抗原样本的相关性最高，因为除了像任何使用抗体的实验手段都要排出的非特异结合以外，对于FACS还存在抗体渗透进死细胞没洗掉造成的假阳性。这也是为什么很多FACS实验会在抗原外额外使用细胞活性染色试剂盒的原因。不过我没有那么精细的要求，一般上机前后用台盼蓝确认至少80%活细胞对我的实验就够了。
  - 荧光扣除对照组Fluorescence minus one （FMO） control：我们平时使用的荧光蛋白和染色剂各自有一个吸收光谱和一个发射光谱。吸收光谱和流式仪的激光配置有关，而多色染色实验中发射光谱的重叠程度会影响各通道间的渗漏leak/background。荧光通道的选择可以参照FPbase的spectra viewer[8]（免疫荧光共聚焦成像同理）。如下图中EYFP和AF532的发射光谱就有大片重叠，因此不建议共同使用；而远红外线区域的AF647就和EYFP几乎无重叠。当然有的时候重叠是不可避免的，所以可以通过流式仪的补偿compensation进行数学计算修正，下图中的0.71和0.67的数字是EYFP和AF532各自在这一波长发散的相对强度（光谱波峰是1）；而补偿修正则是固定波长时计算有多少发散来自EYGP又有多少来自AF532。当然这里只是举例子，现实里不会用重叠这么高的组合，最多也就补偿三七开。

FPbase真诚推荐

抗体染色的时间和温度：至少30分钟，有条件的选择conjugated primary然后延长染色至90分钟；37度和4度——对于我使用的细胞种类——对细胞活性和染色的结果差别不大，但是这个要看抗体和细胞的种类自行确认。
固定和通透剂的使用顺序：之所以这两步都必须在活细胞表面染色后进行，一方面是避免前面iso ctrl提到的死细胞内困住的抗体，一方面是抗体识别抗原表位epitode的条件也是特异的。这一点我会在关键词的常温里专门介绍不同目的的抗体的差异和大多数时候不能通用的理由。除此之外，固定通透后离心时丢细胞的速度会变快（个人感受），一定要小心小心再小心。

数据与分析

我认为看流式图和画流式图的思考过程其实差不多，所以这里按照我常用的上机方法介绍流式数据图：
FSC/SSC 体积、复杂性、活细胞种群分析

前散射Forward scatter FSC和旁散射Side scatter SSC是不需要荧光信号就能得到的第一结果，测量方式涉及流式仪的结构在此不赘述，但可以简单的理解为

前散射区域FSC-A表示的是细胞的体积，区分非单细胞的团块（FSC-A过大）和细胞碎片（FSC-A过小）
前散射的宽FSC-W与高FSC-H比例则可以理解为形状，区分以单细胞和黏在一起的双细胞
旁散射SSC-A表示的是细胞内部的复杂程度。

一个非常实用的FSC/SSC例子就是在血细胞分析中，仅靠FSC/SSC就可以大致区分血细胞的种类[9]。

图自Bio-rad，具体解释在注释的链接里。

流式作图的种类

一维单变量直方图Univariate histograms：横轴通道，纵轴细胞数量；这个最常用的除了卖抗体以外就是细胞周期图，因为可以直观反应染色质的相对数量[10]。

二维图：横纵轴可以是任何通道组合，如横轴FSC-A纵轴SSC-A的细胞大小，横轴FSC-H纵轴SSC-W的单细胞圈门，横轴荧光通道纵轴SSC-A的单一荧光信号表达量，横纵周各是一个荧光通道强度的共表达(Bivariate) quadrant图

点状图：一个点代表一个event（即被检测到的荧光反应，大部分情况下指一个细胞），显示的点的数量可以调整，一般是一万到五万。
密度图：用颜色表示event位置的富集程度，上面给的血细胞的图就是一个例子。

圈门比例：见下
流式圈门的设置原则

圈门Gating既是一种选择局部event的分析手段，也是这种选择的计量方式。一般都上机开始一定会进行的圈门设置有：

FSC/SSC中的活细胞族群（一般标记为P1）。
FSC-H/FSC-A中的单细胞族群（一般标记为P2），下面所有的荧光计量分析一般都只显示P2中占比。
单个荧光通道中的阳性和阴性族群。要注意的是虽然NSC和Iso ctrl都是阴性，很可能会因为添加抗体的操作导致阴性背景的cut-off上移。如下图，标记为阴性组的P4在NSC（左）和实验组（右）中的相对位置的变化，需要额外的Iso ctrl比较；因此在这个实验里我对阳性信号P3的选择非常stringent。

我自己的图，不可以二次使用。

其实单通道圈门也可以通过直方图表达，对于阴性阳性组划分非常清晰的抗体抗原选择直方图更方便，这也是为什么不少卖抗体的都用直方图带货。

比如Abcam的CD84。

两种荧光通道共表达的四象限Quadrant图[11]，中心点的位置的选择是由上面单通道的阴性、阳性对比组合而成的。

不管你把中心点放哪，最后切出来的四个Q都是这个意思。

圈门阶级比例Gating hierarchy。其实发表的时候大多数都是把各圈门/象限的比例写在图上的，但是跑流式的时候机器也会给你这样一张表：

我自己的图，不可以二次使用。

特别案例：ImageStream

ImageStream是一种同时结合流式和IF显微成像的技术，因此同时拥有两种技术的优点：高通量、定量数据与图像结果、亚细胞定位、细胞brightfield和荧光信号结构等等[12]。因为可以计量荧光信号的亚细胞位置和强度，可以作为全细胞/亚细胞西方墨点的备用实验互相验证。
ImageStream样本的准备方法和普通流式没有区别，但是受拍摄功能的影响速度要比普通流式慢很多，因此一般也不会一口气采样太多细胞。得到数据后首先要进行大小、对焦和有核细胞的预筛选，这之后象征表达量的荧光信号强度是以population statistics呈现的（如下，可以选择输出每一样本的细胞数量，mean v.s. median等统计数据证明peak shift），并不能反映绝对含量，在这方面并不能代替绝对定量的ELISA和相对定量的西方墨点。

我自己的图，不可以二次使用

相关提问&示例

参考

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/660444277

图文播报

5.2.2 FACS & FC 流式

登陆有奖并可浏览互动！

发表回复

官方推荐 /3

个人中心