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[分享] 反向PCR技术

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发表于 2024-9-21 09:41 | 显示全部楼层 |阅读模式

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反向PCR技术
反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切,然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接,再用一对反向的引物进行PCR,其扩增产物将含有两引物外未知序列,从而对未知序进行分析研究。
PCR技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR技术由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA 的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火 (复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至 55℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
随着科学技术的不断发展,科研人员在基本PCR的基础上进行了大量改进,开发了许多适用于不同研究目的的PCR,如兼并引物PCR、套式引物PCR、反向PCR、不对称PCR、逆转录PCR、实时PCR等。什么是反向PCR呢?和常规PCR有什么区别?
反向PCR (IPCR)技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的末知序列进行扩增。如图所示:


基本PCR与反向PCR技术的区别:
反向 PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,而常规 PCR 扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。反向PCR是常规聚合酶链反应技术的修改和发展。
反向 PCR技术的原理、方法和意义:
实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切,然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接,再用一对反向的引物进行PCR,其扩增产物将含有两引物外未知序列,从而对未知序进行分析研究。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又可称为染色体缓移或染色体步移。反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。如图所示:


现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。
反向 PCR技术的应用:
反向PCR设计之初是为了用于确定邻近未知区域的序列,多用于研究基因的启动子序列;致癌性染色体重排,如基因融合、易位和转座;以及病毒基因整合,现在也常用于定点突变,复制一个具有预期突变的质粒。
反向PCR技术的不足:
需要从许多酶中选择限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列,这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
反向PCR技术有着自己独特的特点,虽然有不足之处,但它在各学科和各领域都有着重要的作用。随着PCR技术和分子生物学的发展,它在各学科和各领域的作用将会越来越重要,应用也将会更加普遍。
例、反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是(   )


A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B.设计的引物中GC碱基含量越高,退火的温度越低
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶及逆转录酶
解析:由题目中的反向PCR技术可知,通过已知序列设计引物,来扩增未知序列,因此,引物延伸的方向应该是向未知序列,由左图可知,新链合成方向为5'到3',因此应该选择引物1个引物4,扩增的是未知序列,A对C错;一定范围内GC碱基含量越高,退火的温度越高,B错;过程中没有用到逆转录酶,D错。故答案为A。

原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/677409859
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