多模式层析的基本原理介绍

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层析技术是利用不同生物分子之间不同的理化性质如分子量、带电荷、疏水性或独物的亲和性，从而分成凝胶过滤、离子交换、反向和疏水、亲和层析等不同的模式。多模式层析便是一种利用上述一种以上的层析技术，彼此之间单独或者协同发挥作用的层析方式。
在层析技术中，目标分子和配基往往会通过两种甚至两种以上模式的相互作用实现分离，根据水同的目标分子和整体的实验条件，发挥不同种类的相互作用。比如静电、疏水作用、氢键、π-π相互作用、亲硫相互作用等。多模式填料与传统单一模式填料不同的选择性，为解决一些有挑战的纯化项目或者提高传统层析工艺的效率提供新的思路。
相对于传统单一模式的层析填料，例如离子交换、疏水和亲和层析填料采用某一类特定的相互作用对样品进行分离。多模式填料通过不同的配基设计引入新的相互作用，从而产生新的选择性，在不同的实验条件下新的选择性在一些特定应用当中产生了非常好的分离效果。
多模式层析的实验步骤
基于溶质分子通过多种相互作用模式与固定化基团之间的可逆性吸附作用，其中离子交换和疏水相互作用是最常使用的。这种结合-洗脱模式与纯化分为四个步骤进行。第一步是将固定相平衡到所需的起始缓冲条件，当达到平衡时所在固定相上的电荷基因与可交换的抗衡离子如氯离子或钠离子结合。
第二步上样和清洗，该步骤的目的是结合所有目标分子，并洗掉所有未结合的物质，为了使所有目的分子能与固定相基团结合，样品缓冲液应具有与起始缓冲液相同的pH和离子强度。第三步是洗脱，通过改变缓冲液的组成从而使目标分子从固定相上释放，例如改变缓冲液的pH值，在一些情况下缓冲液的pH值的变化伴随着盐离子浓度的增加，但是在某些情况下洗脱可以依赖盐离子浓度的改变，例如向缓冲液中添加氯化钠。最后一步是填料的再生，需要去除所有仍然结合在填料上的生物分子，确保其具有最佳的载量可用于下一次的层析实验，通常可以使用1M氢氧化钠溶液清洗填料。
对于多模式层析实验的前期准备工作，需要多花一些时间支了解这类填料的性能，根据样品性质和纯化目标，选择采用那些多模式填料可以在后续实验中进一步筛选。由于多模式填料具有多种相互作用共同发挥作用，往往提供了更宽的操作范围可选择，因此一些同通量的层析填料类型可以提高效率，根据样品体积和纯化目标选择合适的产品类型，例如96孔筛选板型、小体积的预装柱或者自行装填更大体积的层析柱。如果后续需要进行放大规模，全程还需要考虑工艺的可放大性。
确定实验条件，多模式填料的复合基质需要考虑与传统层析实验相比上样和洗脱条件的不同，例如我们知道离子交换层析是一种低盐上样，高盐洗脱的过程，疏水层析正相反，是一种高盐上样，低盐洗脱的过程。而对于多模式填料而言，我们需要了角样品与包含这两种相互作用模式的填料会发生什么，目标蛋白会在高电导的环境中结合，在什么样的条件下可以洗脱目标蛋白。例如Capto MMC可在高盐条件下结合蛋白，保持一个稳定的高结合载量，在传统离子交换填料无法结合的上样条件下，结合样品。现如Capto adhere 填料在高盐条件下采用流穿模式去除抗体中的聚集体杂质，上样的缓冲液是单一模式的离子交换填料无法达到的。多模式填料带来了新的选择性和更宽的操作范围。
多模式层析实验第三步优化条件，在传统离子交换层析原理中都知道等电点，当蛋白质所在缓冲环境pH值低于蛋白质的等电点，样品会带上正电荷，高于蛋白质的等电点会带上负电荷，pH值越偏离于等电点，所带电荷越多，因此对于一个结合洗脱模式的离子交换实验来说，会选择偏离等电点的区域作为结合pH值的结合范围，而像多模式离子交换填料随着疏水基因的引入，可实现跨等电点的上样结合，带来了更宽的操作范围。
当然在听到这么多优点的背后，多模式层析也有它受限的地方，由于复合模式的引入，多模式层析的最优试验条件需要更多的摸索和优化，而这一点也让大家可能望而却步。
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