ELISA实验技巧汇总篇

wolf · 发表于 2024-9-18 22:49

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酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前应用最广泛的免疫学检测技术，是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng）水平甚至皮克（pg）水平。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA与IHC、WB的区别

1、常用的ELISA方法

目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法ELISA。

#01直接法
将抗原固定于ELISA班上，然后用酶标抗体直检测抗原。
相较于其他类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，检测结果不容易出错，
但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA版结合，实验背景会比较高，而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。
#02 间接法
将抗原固定于ELISA班上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体于抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。
于直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济，间接ELISA还提供了更大的灵活性，
缺点：存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。
03# 夹心法
被检测的抗原包被再两个抗体之间其中一个抗体将抗原固定于载体上，即捕捉抗体，另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量，或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量，这两种抗体必须小心选取，才可以避免交互反应货竞争相同额抗原结合部位。
04# 竞争法
预先将抗原包被再固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体，实验是，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原于预先包被再固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体，如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被再固相载体上的抗原，通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比
竞争ELISA相对以上的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式，其主要有点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。
在测定蛋白质等大分子时常用双抗夹心ELISA方法，在敏感性基因特异性上有明显的优势。

2、双抗夹心法ELISA

#01 原理
双抗体夹心法是检测大分子抗原最常用的方法。双抗夹心法ELISA是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体—抗原—固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。

#02 样本准备

血清
全血标本自然凝集30min后1000×g离心15min，取澄清，即可检测。澄清可存放于-20℃，避免反复冻融。
血浆
可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30min内于2-8℃1000×g 离心15min，或将标本放于-20℃，避免反复冻融。（注意：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测）
细胞上清

收集细胞培养液，离心取上清，-20℃存放，避免反复冻融。
D.细胞裂解样本
①收集细胞后，用预冷的10mM PBS洗3次，5000×g离心5min。
②细胞计数，离心弃上清；
③加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；
④按每1×107个细胞，加入1ml细胞裂解液（含PMSF），冰上裂解30min，其间上下颠倒使裂解更充分，超声波破碎处理；
⑤ 4℃，10000×g离心10min；
⑥检测细胞裂解样本总蛋白浓度；
⑦整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。
E. 组织裂解样本
①加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；
②预先将待检组织用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg组织加1mL裂解液，用研磨器进行研磨，得到的匀浆液可利用超声破碎处理；
③4℃，10000×g离心10min，取上清，-80℃存放；
④检测组织裂解样本总蛋白浓度；
⑤整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。
#03 实验操作流程
1.标准品和样本制备
2.酶标板拆分
3.标准品和样本点样
4.生物素抗体制备
5.洗液配制
6.浓缩HRP酶结合物工作液配制
7.显色
8.终止反应
9.上机与数据分析

3、如何选择ELISA试剂盒？

1.特异性：ELISA试剂盒的特异性于试剂盒的关键组分，抗体对有关，若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗，建议使用双单抗，
2、灵敏度：灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的能力，用户可根据自己样本中待检指标的量选择合适的试剂盒，如果待检指标量很低，一般的试剂盒不能满足要求，可选择高敏的ELISA试剂盒。
3、重复性：科学实验讲求重复性，一般ELISA试剂盒，期板内和板间变异系数应该控制在15%以内。
4、简便性：试剂盒在保证高质量数据的情况下，实验时间越短，操作越便利，越容易受到用户欢迎。

4、ELISA 试剂盒常见问题解析

5、10条ELISA 实验通用技巧

室温
确保所有试剂在使用前均平衡至室温（除非另有说明）。
防潮
如果有剩余检测孔，则将剩余的孔板密封保存，以防止有效成分降解。
分装
对于非一次性使用的标准品，将剩余标准品等分至较小体积并冷冻保存，以防止反复冻融。
使用多道移液器
多道移液器可以加快标准品和样品的铺板速度，并得到更一致的结果。
加样角度
加样时，将移液器枪头保持一定倾斜角度，不要接触微孔底部。
更换移液器枪头
建议在不同样品或标准品之间更换移液器枪头，以防止污染。
尽量使用洗板机
因为使用多道移液器手动洗板可能导致更高的背景，因此建议使用洗板机。
增加浸润时间
在手动或用洗板机清洗微孔板时，在两次洗板步骤之间增加 30 秒的浸润时间，便于洗涤缓冲液发挥功效。
孵育时间
密切关注孵育时间，每小时孵育时间的误差应控制在 5 min 内。
多板操作，切勿叠放

如果正在进行多板操作，请勿在孵育期间将微孔板堆叠在一起，而应单独放置在平坦表面上。

6、ELISA Calc软件（四参数Logistic拟合）+ELISA计算模板

ELISA实验完成后，最重要的工作就是将OD值转化为浓度了，那么如何进行呢？首先，我们要绘制标准曲线，目前绘制标准曲线常用的方法有Excel绘图或者专用的Curve软件作图。常规的拟合回归方程有6种：直线拟合、二次多项式拟合、三次多项式拟合、半对数拟合、Log-Log拟合、四参数拟合，其中四参数拟合曲线，最能满足ELISA数据分析的要求，是最常见的ELISA 数据分析的方法。
①使用ELISAcalc软件就可以采用四参数拟合方程来处理ELISA 数据。

②如果样本比较多，希望能批量处理，这里有制作好的Excel表格，直接输入数据就能得到结果。