关于液体活检你需要知道这些

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什么是液体活检？
血液中，除了白细胞、红细胞、血小板和血浆等，还存在许多细小的DNA片段。血液基因检测，又称液体活检，是指对血液中来源于实体肿瘤的DNA片段进行测序，找基因突变或者其他基因组变异，这些片段又被称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。



液体活检的简要流程，图源：inivata.com

为什么血液里能检测出肺等其他器官中肿瘤的DNA？因为虽然实体肿瘤是长在某个器官中，但仍通过血管和血液系统有着密切的联系。当肿瘤细胞的DNA脱落，或肿瘤细胞死亡后，DNA会进入血液循环系统，如果能捕获到这些肿瘤细胞的DNA片段，就能进行基因测序，间接知晓肿瘤的基因突变状况。
液体活检有哪些优势？
相比于组织活检，液态活检技术主要有具有无创、可重复性强、可实现早期诊断、进行动态监测、克服肿瘤异质性等优势。
>>>>无创
组织活检通常需要外科手段进行组织的获取，在获取组织的同时，可能存在出血、疼痛、感染、肿瘤播散等风险。另外，对于有些位置较为特殊或者不能耐受的患者，组织活检风险更大。相比于组织活检，液体活检最显而易见的优势就是无创，对位置要求低，可操作性强，痛苦小，患者接受度更高。
>>>>发现临床手段无法检测到的肿瘤组织
组织活检主要依赖于影像学检查，在肿瘤早期或术后无瘤期间，影像学上无占位效应。但血液或其他体液中却可能存在一些肿瘤相关信息，例如肿瘤细胞释放的 DNA 片段或外泌体等，通过液体活检可以实现肿瘤早期筛查以及术后的复发风险预测等。
>>>>液体活检的实时效应
液体活检标志物的半衰期很短，时效性较强。有研究表明 ctDNA 的半衰期仅不足 2 小时，这使得其可以精确反映肿瘤实时信息，达到指导用药、疗效和耐药监测等目的。有研究显示，液体活检的平均耗时为 9 天，组织活检为 15 天，这表明液体活检可以更早地为临床提供有效的信息。
>>>>实现动态监测
液体活检由于其灵活无创的特点，可重复性强，故可以实现对于复发、疗效或耐药的动态监测。影像学的提示往往会滞后，并且仅能显示肿瘤形态的变化，对于肿瘤内部如不同亚克隆间的消长无法分析，而且频繁的检测也有辐射带来的危害。
>>>>克服肿瘤异质性
由于肿瘤的异质性较强，不同个体的肿瘤、同一个体不同部位的肿瘤，同一部位的不同亚克隆组织，同一亚克隆的不同细胞，其中的遗传信息都可以是不尽相同的。传统的组织活检，是取病变组织的一部分做检测，存在局限性。液体活检取自全性循环 DNA 分子，理论上更全面，异质性偏差更低。如果结合组织活检和液体活检，则可进一步提高阳性率，使更多患者获益。
哪些情况下适合采用液体活检？
液体活检最大的优势在于微创、快捷，易于动态监测；一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态，不受肿瘤异质性影响；适用人群更广泛，对于难以取得活检肿瘤组织或取得肿瘤组织不够基因检测的患者，液体活检提供了一个了解肿瘤基因变异状态的有效途径。
然而，液体活检最大的劣势在于其并非富集肿瘤的检材，大量的正常组织释放基因组DNA稀释了肿瘤来源的DNA，造成ctDNA突变丰度很低（一般低于1%），对ctDNA突变的检测无异于大海捞针，或者更形象地说：从一堆稻草（正常组织来源的循环游离DNA）中找一根针（来自肿瘤细胞的ctDNA）一样困难，因此对ctDNA的检测方法灵敏度提出了更高的要求。
1. 早期诊断
肿瘤的早期诊断其最大特点为肿瘤负荷很低，可能影像学上都没有明确的肿瘤病灶。此时血液中ctDNA的含量亦极低，普通针对ctDNA突变的检测难以满足早诊的要求。
值得庆幸的是，细胞从癌前状态向癌症发展过程中，DNA甲基化改变是贯穿整个恶性转化的表观遗传学改变。即使在肿瘤发展的最早期阶段，DNA甲基化模式也已经与正常细胞存在显著差异；其次，甲基化水平的改变是具有组织特异性的，即对甲基化进行检测及比对，能够进行器官溯源，发现到底是哪里可能会发生或已经发生了肿瘤。
因此，对ctDNA的甲基化水平进行检测，是一种有效的肿瘤早期筛查辅助手段。比如SEPT9基因甲基化检测试剂盒对结直肠癌诊断的敏感度及特异性可达74.8%及97.5%[1]，现在已经可以作为一种结肠镜前的初筛手段。
2. 指导靶向治疗
肿瘤的靶向治疗是目前临床最常见的ctDNA检测应用场景。根据《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》[2]，如果有肿瘤组织，推荐直接用肿瘤组织进行驱动基因检测；但若没有肿瘤组织样本或者肿瘤组织样本不足的情况下，液体活检可作为很多患者基因检测的首选。
由于中国非小细胞肺癌人群中EGFR为最常见的驱动基因变异（约40%-55%），此时对肿瘤驱动基因的检测，既可以使用Cobas或者Super-AMRS法对EGFR基因常见突变进行检测，也可以使用NGS，一次性对所有肺癌相关驱动基因变异进行全面检测。
但无论是何种检测方式，应注意的是若组织活检或者液体活检有任何一个是阳性，患者就应当考虑使用靶向药物；当液体活检先行的时候，若液体活检为阴性，应提示患者可能存在假阴性，必要时再取活检，以避免错失可能的靶向治疗机会。
3. 耐药监测
靶向治疗终归面临耐药的问题，而液体活检由于微创快捷的优势，是理想的耐药监测材料。对于EGFR一代或二代TKI用药人群，约半数以上的患者出现EGFR 20号外显子T790M而耐药[3]，因此对于此类患者的耐药监测可使用敏感度高且成本低的数字PCR法对T790M单点进行监测。如果患者已经出现了耐药，亟需探索其耐药机制以更换治疗方案，此时推荐使用NGS对基因变异的整体状态进行检测，以便全面寻找耐药原因。
4. 预后评估
在预后评估方面，微小残留病变（MRD）是目前研究的热点。MRD指的是治疗后传统影像学和实验室方法无法发现，但通过分子诊断可发现肿瘤来源的分子异常。多种肿瘤的相关研究表明，ctDNA突变状态可提示接受根治性治疗的患者的预后复发，并已在部分临床实验中得到应用。
血液样本送检有哪些注意事项？
血液的规范化处理是保证液体活检结果准确的基本前提。在血液样本的送检方面应注意以下几点：
1. 采血管的选择
用于ctDNA检测的血液需使用EDTA抗凝管或者cfDNA专用采血管。若使用EDTA抗凝管，血液离体后应尽量保存于4℃，2小时内需尽快进行血浆分离；若使用cfDNA专用采血管，血液可在常温保存3-5天。切记严禁使用肝素抗凝管，因为肝素在后续DNA提取过程中难以去除，并且会抑制PCR反应，导致后续ctDNA检测失败。
2. 采血量及采血注意事项
一般而言，ctDNA检测需要采集8-10ml的全血。采血后严禁剧烈震荡血液，或者使用注射器针头对血液进行转移，因为这样的操作均会导致血液中细胞破裂，从而造成基因组DNA的污染，增加ctDNA检测的假阴性；此外溶血造成血红蛋白及其代谢产物的大量释放，从而抑制PCR扩增效率。采血后应轻柔将采血管颠倒8-10次进行混匀。
3. 患者采血时间的选择
一般建议患者空腹进行抽血，特别是血脂较高的患者。这是由于低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收的作用，会干扰后续ctDNA的相关检测；三酰甘油会降低ctDNA的提取率；若使用微滴式数字PCR检测技术，血液中的脂质会影响后续微滴的生成。此外，对于正在进行化疗的患者，一般建议患者化疗结束后进行抽血。
参考文献
[1]Jin P, Kang Q, Wang X, Yang L, Yu Y, Li N, et al. Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm. Journal of gastroenterology and hepatology. 2015 May;30(5):830-3. PubMed PMID: 25471329.
[2]吴一龙. 非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识. 中华医学杂志. 2015.
[3]O'Kane GM, Barnes TA, Leighl NB. Resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, T790M, and clinical trials. Current oncology. 2018 Jun;25(Suppl 1):S28-S37. PubMed PMID: 29910645. Pubmed Central PMCID: 6001758.
*内容整理自：丁香园肿瘤时间、医学界肿瘤频道、癌度
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