protocol 分享｜流式鉴定细胞表面抗原

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简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是利用流式细胞仪检测单个微粒（单细胞悬液、生物颗粒等）的多项特性或对特定群体加以分选的一门技术，具有快速、准确、客观的特点，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。
原理
特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流内的细胞，产生的光信号被多个接收器所接收，一个是在激光束直线方向上接收到的前向角散射光信号（FSC），其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号，包括侧向角散射光信号 （SSC）和荧光信号。
液流中悬浮的直径从 0.2~150 μm的细胞或颗粒能够使激光束发生散射，细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。
散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收，根据接受到的信号的强弱波动从而反映每个细胞的物理学特征。（通俗的讲就是激光束照射由鞘流液包裹的细胞，产生两种光信号，即散射光信号和荧光信号）。
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发波长不同；每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送到不同的光电倍增管。
用途
液流技术、细胞的计数和分选技术等。
材料与仪器
待检测样本、流式直标抗体、PBS
流式 stain buffer、EP 管
固定剂（4% 多聚甲醛）
红细胞裂解液（血液样本选用）
步骤
一、细胞流式
1、倒掉细胞培养液，用适量 PBS 把细胞洗一遍，将细胞用胰酶或枪吹打下来，1000 rpm离心 15 min，用 1 ml 流式 stain buffer 重悬，放入标好标签的 EP 管中
2、300 g，4 ℃，离心 5 min,弃上清，用 100 μL stain buffer 重悬细胞。
3、加入适量体积的细胞表面标记物偶联抗体或同型对照。
4、4 ℃ 避光孵育 30 min 以上（可放置旋转仪上旋转以充分孵育）
5、加入 1 ml stain buffer 清洗细胞，300 g，4 ℃，离心 5 min，弃上清（如不需要破膜直接跳至第 10 步）
6、加入 100 μl 固定剂，室温下避光孵育 15 分钟。
7、用 1 ml stain buffer 洗涤一次
8、300 g，4 ℃，离心 5 min，弃上清，加入 100 μl 破膜剂和适量体积的胞内抗体或相应同型对照，4 度避光孵育 20min~30min（可放置旋转仪上旋转以充分孵育）。
9、加入 1 ml stain buffer 清洗细胞，300 g，4 ℃，离心 5 min，弃上清。
10、用 200 μL stain buffer 重悬细胞，及时上机分析；或用 200 μL 4% 甲醛固定，2~8 °C 避光保存，并在 24 小时内对固定完的细胞进行分析。
二、组织流式
1、取适量新鲜组织于标记好的 EP 管中，加入 1 ml PBS。用剪刀将组织剪成碎块，用匀浆机将组织匀至单细胞悬液（基本看不到大块组织）。
2、过滤器除去组织残渣
3、300 g，4 ℃，离心 5 min，弃上清，用 100 μL stain buffer 重悬细胞。
4、加入适量体积的细胞表面标记物偶联抗体或同型对照。
5、4 ℃ 避光孵育 20min~30min（可放置旋转仪上旋转以充分孵育）
6、加入 1 ml stain buffer 清洗细胞，300 g，4 ℃，离心 5 min，弃上清（如不需要破膜直接跳至第 11 步）。
7、加入 100 μl 固定剂，室温下避光孵育 15 分钟。
8、用 1 ml stain buffer 洗涤一次。
9、300 g，4 ℃，离心 5 min，弃上清，加入 100 μl 破膜剂和适量体积的胞内抗体或相应同型对照，4 ℃ 避光孵育 30 min 以上（可放置旋转仪上旋转以充分孵育）。
10、加入 1 mL stain buffer 清洗细胞，300 g 4 ℃ 离心 5 min，弃上清。
11、用 200 μLstain buffer 重悬细胞，及时上机分析，或用 200 μL 4% 甲醛固定，2~8 °C 避光保存，并在 24 小时内对固定完的细胞进行分析。
三、全血流式
1、取 100 μl 肝素抗凝的人外周血， 加入适量流式抗体，混匀，4 ℃ 避光孵育 20~30 分钟。（如需破膜可参考上述破膜步骤）
2、加入 1.5×红细胞裂解液 2 ml 混匀，室温避光孵育 10~15 分钟，至液体澄清透明（若溶液未澄清透明，请重新振荡混匀，再放置 2 分钟，至液体澄清透明）。
3、1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清。
4、加入 1 ml stain buffer 混匀， 300 g 4 ℃ 离心 5 min，弃上清。
5、用 200 μL stain buffer 重悬细胞，及时上机分析，或用 200 μL 4% 甲醛固定，2~8 °C 避光
保存，并在 24 小时内对固定完的细胞进行分析。


血液或骨髓流式细胞术实验步骤及圈门示意图（Circulation. 2020 Mar 31;141(13):1080-1094.）


心脏或脾脏等其他实体组织流式细胞术实验步骤及圈门示意图（Circulation. 2020 Mar 31;141(13):1080-1094.）
注意事项
1. 我们这里所介绍的是细胞表面抗原的检测，细胞内抗体需要进行破膜步骤。不同胞内抗体需搭配使用不同破膜试剂盒，建议使用前咨询购买抗体的公司需使用何种破膜试剂盒。
2. 流式细胞术一般用于活细胞检测，通常需要当天完成上机前的所有实验，如果当天来不及处理，可以用多聚甲醛固定液固定，然后放置 4° 冰箱隔天进行上机检测。
3. 流式上机前一般需要制备单染管，尤其是进行多重标记，可以进行荧光补偿调节。
常见问题
1. 利用流式细胞术进行多抗体标记时，应该如何选择抗体？
首先需要确定所在实验室使用的流式细胞仪支持的荧光通道，这是最先需要明确的，其次可以通过调研已发表文献，参考文献中使用的多色抗体及门控通道。
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