核酸分离（上）---DNA提取那点事

莺歌燕舞

基因工程的核心技术是基因克隆技术，也就是DNA重组技术。要实现DNA分子的体外拼接重组，并在宿主细胞的持续稳定表达，选择目的基因、工具酶、载体和宿主，基因组DNA可直接作为pcr克隆的模板，质粒DNA是构建载体必须的，以及自动化磁珠法大量提取DNA,这些操作的基础核酸分离，核酸样品的质量将直接影响到后继实验的结果，下面小编给大家介绍一下核酸分离技术的常用方法，希望对刚入实验室的小白有一些帮助。
一．核酸提取和纯化的主要步骤
核酸分离总的原则是要保证核酸一级结构的完整性，防止降解，同时要排除其他分子的污染。因为一级结构是核酸分子最基本的结构，储存着全部的遗传信息，是进一步研究的基础。为了保持核酸的完整性，在提取过程中要注意防止核酸酶对核酸的降解。还要防止化学因素(酸碱等)和物理因素(高温或机械剪切等)引起核酸变性或破坏。制备RNA要特别注意防止核酸酶的作用，因为核酸酶分布很广，活力很高，而对DNA更重要的是防止张力剪切作用，因为DNA分子特别长，容易断裂。
提取纯化DNA总的来说分为四大步骤:样品的前处理、细胞破碎、除去与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质、核酸的沉淀浓缩，除去其他杂质核酸，获得均一的样品。
1.样品准备
新鲜的动植物组织材料，经清洗去掉非组织材料杂质。少量样品可用液氮冻结，然后快速碾磨成粉末状。动物细胞培养物有的需用胰酶消化，再离心沉淀，必要时用预冷的PBS液漂洗，收集沉淀的细胞。液体培养的单细胞微生物直接离心沉淀收集菌体，重悬浮在含有EDTA的葡萄糖低渗溶液，避免细胞裂解。
2.细胞破碎
细胞的破碎有各种方法，包括物理方法、化学方法、酶法等。常用的物理方法有超声波法、匀浆法、液氮破碎法、Al2O3 粉研磨法等。物理方法易导致DNA链断裂，因此大分子量DNA，一般采用化学方法和酶法，如采用去污剂(SDS,0.5%-1.25%)和溶菌酶或蛋白酶K,在Tris-HCl(pH 8.0)的EDTA溶液中，温和裂解。EDTA(5mmol/L)可与Mg2+ 结合，从而抑制核酸水解酶，是核酸制备中防止酶解的重要手段。蛋白酶，去污剂在使细胞充分裂解的同时，也可使核蛋白复合体破碎，从而使更多的核酸释放出来，溶解于提取缓冲液中。为充分裂解细胞，消化蛋白，此过程可在室温至60°C条件下进行。加入适量RNA酶除去混杂的RNA。
3.分离纯化DNA
核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质，从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。从核酸溶液中去除蛋白质常用酚/氯仿抽提法，这个方法的基本原理是:交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白杂质的效果。氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的痕量酚。如果下一步骤中酶反应的条件要求严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样品中的痕量酚与氯仿，然后在68℃水浴中放置10min使痕量乙醚蒸发掉。


4.核酸的沉淀浓缩
常用的是乙醇沉淀法。无水乙醇结合核酸分子所结合的水，使核酸沉淀，且乙醇易挥发除去，对后续酶切操作影响甚微。
二、基因组DNA的制备
基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。如SDS加上蛋白酶K温和裂解过夜，蛋白酶K具有水解蛋白的能力，加速细胞膜的裂解，SDS变性膜蛋白，同时具有解离核酸结合蛋白的能力，同时SDS的存在还可抑制可能存在的核酸酶活性，防止提取过程中基因组DNA的降解。杂蛋白质的去除可用酚/氯仿萃取法。对植物基因组可能需要注意的是糖类的除去，可选用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)选择性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化铵(TEAB) 加上50%乙醇沉淀多糖。目前针对DNA的分离纯化，各试剂公司均有试剂盒提供，可选择合适的试剂盒提取，增加DNA的得率和纯度。


1.血红细胞的裂解
①在50ml已消毒的离心管中加入30ml细胞裂解液，轻轻摇动血液样品管至样品完全混合，将血祥(10ml)转移到已加有细胞裂解液的管中，将管颠倒几次混匀，室温下温育10min (期间颠倒2-3次)以裂解血红细胞，室温下以2000g离心10min，移除上清液，
2.核的裂解和蛋白质的沉淀
①向含有重悬细胞的试管中加入10ml核裂解液，如果有成块细胞出现，将溶液放置于37℃进行温育直至细胞块完全破坏。向裂解产物中加入3ml蛋白质沉淀液，剧烈振荡10-20s后可能会看到小的蛋白质块。
2000g离心10min。
3. DNA的沉淀和再水合
将上清液转移到一个装有10ml异丙醇的50ml干净试管中，轻轻颠倒混合溶液直至白色线状DNA变形可见的块状DNA，2000g离心1min，倒出上清液，加入10ml 70%乙醇，轻柔地颠倒试管数次以洗涤DNA沉淀和试管壁，离心，吸出乙醇。试管颠倒后放置在干净的吸水纸上，风干沉降物10-15min.加入800ul DNA再水合液，65℃溫育5min使DNA再水合，离心。
二、质粒DNA的分离
在基因工程中，质粒是携带外源基因进人细菌中扩增或表达的重要运载体，是重组DNA技术中必需的工具。而质粒的分离提取则是最常用、最基本的实验技术。质粒DNA分离方法有碱裂解法、煮沸法、去污剂(Triton/SDS) 裂解法、CsCl-EB (氯化铯溴乙啶)密度梯度平衡离心法、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法及商业化的试剂盒等。前两种方法比较剧烈，适于小质粒，第三种方法比较温和，一般用来分离大质粒(> 15kb)。
1. 碱裂解法
碱裂解法是小量制备DNA较好的方法。基本原理是利用质粒较小且为超螺旋共价闭合环状分子的特点，它与染色体DNA在拓扑学上有很大差异来分离。即在碱性pH(12~12.5)下，DNA分子均变性，恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能准确复性，就与其他成分共沉淀，而质粒DNA分子小且两条闭合环状分子及时变性也较紧密的缠绕在一起，准确复性而留于上清溶液中。碱裂解法获得DNA纯度可达到基因工程操作的要求，提取率高，能快速获得超螺旋DNA，常用于高拷贝数质粒的分离提取。质粒的大量制备可采用微量制备的方法提取后，再采用聚乙二醇沉淀等方法纯化。
2. 煮沸法
煮沸法利用加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，通过高速离心(12000g)将两者分开。然后可用5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)选择性沉淀DNA, 进一步用乙醇洗涤、沉淀，保存于TE缓冲液中。适于快速提取质粒DNA并进行鉴定，也适用于大量提取，对纯度要求高的，可做进一步纯化处理。
三、磁珠法提取DNA
随着基因诊断、转基因食品检测、个性化医疗等的快速发展，现在的核酸提取技术已经不能够满足当今生物技术的需要，急需能够高通量、自动化的核酸提取方法。在这种背景下，磁珠法核酸提取应运而生。
原理与硅胶膜离心柱相，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。
磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解——结合——洗涤——洗脱。


四、DNA提取成功的要点
1、裂解液要预热，以抑制DNase,加速蛋白变性，促进DNA溶解。
2、酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
3、各操作步骤要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。
4、取各上清时，不应贪多，以防非核酸类成分干扰。
5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
说到这，大家对DNA提取有一些了解吧，大家可以学习一下分子克隆实验指南（第四版），书中的介绍常用实验方法，步骤非常实用。

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