玩转质谱|1|：什么是质谱

青草

前言
液相色谱-质谱（LC-MS）是一种将高效液相色谱的分离能力与质谱的检测优势相结合的技术。体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与 MS 具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，进入21世纪后，质谱技术在生物制药、食品安全、环境监测、化工能源、生命科学、法医毒物鉴定等各个领域取得了长足的发展。特别是液相色谱-质谱联用技术的发展，极大的拓宽了质谱技术的应用领域，成为目前最主流的质谱工作模式。随着精准医学的发展，液质联用技术开始被应用于临床检验领域，如遗传代谢疾病筛查、维生素检测、激素检测、疾病标志物的检测、治疗药物监测、多组学研究等。
质谱是什么
质谱是特殊的天平，可以称量离子的质量。质谱学就是通过制备、分离、检测气相离子来研究气相离子结构、性质及反应行为的科学。



简单定义：用于称量分子的机器。分子大小。
质谱是如何使用
质谱是一种强大的分析技术，用于识别未知化合物、量化已知材料以及阐明分子的结构和化学性质。
简单的定义:
质谱仪被用来帮助科学家:
1. 识别固体、液体和气体中的分子。
2. 确定每种分子的数量。
3.确定哪些原子组成了一个分子，以及它们的排列方式。
质谱分析


排序和计数
零钱(混合硬币)    （混合物的分子）
一分，一角，五分，四分之一，五分  （不同重量，大小的分子）
根据值或大小进行排序   （分离的质量）
不同大小的硬币分开 （质量范围）
质谱能做什么
定性：测定化合物的结构；
定量：测定混合物的组成。
【特性1】能够广泛分析多种机体分子



凡能成为带电粒子（离子）的机体分子都能成为广泛的分析对象。因此,从微量金属元素、气体分子等难以制作探针的低分子化合物,到蛋白质、RNA等大分子,这些构成机体的各种分子都能成为分析对象。

【特性2】能够鉴定未知分子



借助MS能够得到分子本身的结构信息。所以可以鉴定出实验前未曾预料到的分子或者未知分子。另一方面，使用探针(抗体等)的方法需要预先制作或选择探针,不适用于未知分子的鉴定。
【特性3】能够一次性测定多种成分(网络式分析，即组学）



能够一次性测定多种分子。根据这个特点,MS常被灵活应用于对机体分子群进行网络式分析的差异蛋白质组学、差异代谢组学中。
质谱究竟能做什么
事实上,在生命科学研究中MS早已不是次要的实验方法了。在PubMed检索关键词“massspectrometry",能检索出193070篇热门论文。当然不能简单地用相关论文条数进行比较,但是这个数量与RNA分析方法"in situ hybridization" (107989条)和"PCR" (294466条)相比能处于中等水平,随着年数增长,论文条数也有逐年增加的趋势。然而MS的广泛适用性带来的多种多样的用途，使得生命科学研究中MS的应用难以以一概全。



① “发现”新因子
→用于分子种类/因子鉴定分析的MS
② “测定”生物分子
→用于定量分析的MS
③对组织局部分子信息“可视化”
→用于分子成像的MS
液质工作原理
液质联用（LC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品通过液相色谱分离后的各个组分依次进入质谱检测器，各组分在离子源被电离，产生带有一定电荷、质量数不同的离子。不同离子在电磁场中的运动行为不同，采用质量分析器按不同质荷比（m/z）把离子分开，得到依质荷比顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，可以得到样品的定性和定量结果。



LC-MS主要包括液相色谱系统、接口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统、电气系统和数据处理等。
1）离子源
离子源是使物质电离，给物质带上正电荷或负电荷的装置。液相色谱-串联质谱仪的离子源一般为电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）。由于质谱检测的物质为气态离子，当质谱与液相色谱仪串联使用时，样品随流动相一起进入质谱，首先到达质谱的电子源进行离子化和脱溶剂处理。在离子化方式上，ESI源和APCI源有所不同。ESI源电离时，在喷雾电压的作用下（高达数千伏），液流首先被带上电，然后在雾化气的作用下形成喷雾，雾化的液滴在高温脱溶剂气的作用下蒸发，表面积缩小，电荷密度增加。当液滴表面电荷之间的斥力大于滴液表面的张力时，发生“库伦爆炸”，形成更小的液滴，这一过程不断重复，最终形成气态的物质离子。ESI源一般用于极性化合物和部分非极性化合物的电离。一些大分子聚合物，多肽，蛋白质等分子可以在ESI源中电离，带上多个电荷。另一个优点为ESI源是一种软电离方式 ，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，这些特点极大地拓宽了ESI源的适用范围，适用性较APCI源广。但由于在溶剂挥干之前液滴就已经带上了电，导致液滴中的干扰物与分析物产生电荷竞争，所以ESI源很容易受到基质效应（离子抑制）的影响。


图：电喷雾离子源（ESI）的工作原理
当使用APCI源时，样品溶剂首先形成喷雾，然后电晕针放电使气体分子带上电，依次传递给溶剂分子和目标物分子，带电方式是一种电荷传递。目标物分子带电之前得到了一定程度的“气相分离”，故APCI源的基质效应一般小于ESI源，但也正因为APCI源要依靠溶剂分子来传递电荷，所以使用APCI源时一般液相的流速要比ESI源大。尽管APCI源使用范围要比ESI源小的多，但对于某些极性较小的化合物的电离，如脂溶性维生素的电离，APCI源的电离效率优于ESI源。APCI源的另一个缺点是只能带单电荷，无法分析多肽和蛋白质，且不适合热不稳定化合物的分析。无论是ESI源还是APCI源，工作环境都是在正常大气压环境中，因此这类离子源也称为大气压电离源（API源）。


图：大气压化学电离源（APCI）的工作原理
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液质（LCMS）离子源的清洗
2）接口
样品在离子源中形成离子后，在负压（从离子源到质量分析器，真空度越来越高）和电场力的作用下，进入质谱内部，在达到质量分析器之前，一般需要通过接口和离子传输系统。
这里的接口指的是使离子束从离子源进入质谱内部的入口部件，属于离子导向装置的一部分。目前市场上的质谱仪的接口主要分为两大类，一类为锥孔结构的接口，另一类为毛细管结构的接口，无论哪种接口，其主要作用是使目标物离子通过接口进入到真空环境下的质量分析中，而将辅助离子化的各种气体、中性分析、样品基质等物质阻挡在真空外面。接口技术直接影响质谱仪稳定性、精密度、抗污染能力等性能。


图：各种质谱仪的接口结构

3）离子传输系统
样品离子通过质谱仪接口后，进入到离子传输系统，其作用一般是为了除去进入的中性分子，聚焦离子束，使离子最有效地传输到质量分析器。主流的质谱厂商都拥有众多专利化的离子传输技术，如四极杆/六极杆和八极杆离子聚焦技术、离子漏斗技术、离轴离子聚焦技术、高压碰撞聚焦技术等。其目的都是为了减少中性分子的干扰，提高离子的传输到质量分析器中的效率。由于离子传输系统是离子源过渡到质量分析器的中间部件，离子传输系统的另一个作用是改善系统的真空分配，使系统可以平稳地从大气压过渡到质量分析器的高真空状态。离子传输系统对质谱仪的作用非常关键，直接影响到质谱的抗污染能力和灵敏度。


图：各种离子传输系统的结构

4）质量分析器
质量分析器为质谱仪的核心部件，本系列第一期详细的阐明了质谱仪不同的质量分析器的原理，这里就不在赘述。无论何种质量分析器，其目的都是分离不同质量的离子，物质分子电离后的质量m与所带电荷的数量z的比值称为质荷比（m/z），不同的物质的质荷比不同，因此，通过质量分析器时按照离子质荷比被分离。


图：各种类型的质量分析器

5）检测器
化合物分子通过质量分析器，最终到达质谱仪的检测器。检测器由高能打拿极和电子倍增管或光电倍增管组成，作用是将离子束信号转化为电信号。打拿极富含电子发射材料，被离子束撞击时会喷射出多个电子，被喷射出的电子被电子倍增管放大变成软件能够识别的电信号。通过记录电信号的强度可以用来计算化合物浓度。


图：质谱仪的检测器

6）真空系统
质谱仪的离子传输系统、质量分析器和检测器必须在真空状态下工作，以减少本底干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。质谱仪的真空系统一般由外置的机械泵和质谱仪内部的分子涡轮泵提供，通常采用两级抽气结构，前级为机械泵，后级为分子涡轮泵。工作时先由前级泵，将真空腔内的压强降低几个数量级，再由后级泵降至工作所需压强。


玩转质谱|16|：质谱机械泵维护指南
机械泵维护指南

对于典型的LC-MS系统，完整的实体可分为四个基本组件（如图1所示）：液相色谱仪、离子源、质量分析器和检测器。

• 液相色谱仪（由泵、柱温箱、自动进样器组成）将承担化合物分离的工作。
  
• 离子源用作在气相中产生带电物质的装置，用于目标分析物，用于后续质量分析。
  
• 质量分析器通过质荷比（m/z）过滤分析物离子和分析物离子片段。
  
• 检测器将离子的数量转换为输出到计算机的信号。
  

液相分离
LC使液体样品或固体样品溶液中的分析物发生物理分离。将几微升样品溶液注入流动的溶剂流中，称为流动相。尽管最佳进样量取决于实验条件，但使用自动进样器可以精确进样0.1µL至100µL的样品。流动相连续泵送通过通常填充有涂覆有另一种液体（固定相）的二氧化硅颗粒的色谱柱（不锈钢管）。当样品溶液-流动相混合物到达色谱柱时，其成分将根据其化学组成或物理性质与固定相（保留在色谱柱中）进行微分作用。根据分析物与固定相之间相互作用的机理，LC分离已分为不同模式，例如：





有些分析物与固定相的相互作用比其他分析物更强烈，导致它们在通过色谱柱时分离。与固定相的相互作用最小的分析物首先从色谱柱中流出。随着流动相继续流过色谱柱，其余的分析物依次被冲出，相互作用最强的分析物最后出现。特定分析物在色谱柱中停留的时间是该分析物的特征，称为其保留时间（RT）。
质谱检测
尽管已有多种不同技术和灵敏的检测器与液相色谱法结合，用于分析不同类型的样品，但质谱仪已成为一种选择性强、灵敏度高且通用的检测器。
与其他检测器不同，携带分离的分析物的LC洗脱液不允许流入质谱仪。当LC系统在环境压力下运行时，质谱仪在真空下运行，并且两者通过接口耦合。当色谱柱洗脱液流入界面时，通过加热使溶剂蒸发，分析物分子蒸发并离子化。这是至关重要的一步，因为质谱仪只能检测和测量气相离子。

由于分析物离子是在接口的大气压力下产生的，因此这一过程被称为大气压电离（API），而接口则被称为 API 源。电喷雾离子化（ESI）和常压化学离子化（APCI）是 LC-MS 分析中最常用的离子源。



分析物离子被吸入质谱仪，在质谱仪中受到电场和/或磁场的作用。通过改变外加场改变离子的飞行路径，从而确保根据离子的质量比电荷（m/z）值将其相互分离。分离后的离子可被各种质量检测器收集和检测，其中最常见的是电子倍增器。当分离的离子撞击到电子倍增器（dynode）表面时，会释放出二次电子。这些次级电子通过一系列打拿极级联而倍增。测量次级电子流产生的放大电流，并将其与质谱仪中任何给定瞬间的离子浓度相关联。



绘制质谱数据
通过LC-MS分析样品期间测得的离子丰度绘制为总离子色谱图（TIC）。该图显示了分析物离子的峰强度与其RT的关系。此外，色谱图中的每个点都与质谱关联。质谱图描绘了离子丰度与测得的m/z值的关系



其中，第一个平面显示的是液相色谱分离的保留时间，第二个平面显示的是质谱分析的质荷比（m/z)，第三个平面显示的是离子强度。
化合物的质谱不仅提供了母体化合物的质量信息（来自其离子的 m/z 值），还有助于通过同位素质量峰的相对丰度来阐明化合物的结构。分析峰的面积可用于定量。

END



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