有谁了解液体活检技术，CTC和ctDNA哪种技术更成熟？国内有没有可以做液体活检的公司？

临床医师

有谁了解液体活检技术，CTC和ctDNA哪种技术更成熟？国内有没有可以做液体活检的公司？
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继续前进

在对抗癌症的战争中，治疗的第一步是对问题的准确诊断，一种有助于规划更好的治疗方案的技术是活检。
近年来，液态活检能够通过血液或其他体液而不是固体组织来检测疾病，由于其非侵入性和直接的性质，已经比外科活检更受欢迎。
液态活检主要针对一种叫做「游离DNA」（cfDNA）的分子标记物，它提供了样本中存在致病DNA的信息。
为了能够进行下一步的分析，cfDNA必须被提取和纯化，由于其丰度较低，这是一项具有挑战性的任务。
一种称为「固相萃取」的cfDNA纯化方法是提取和纯化的金标准，它依赖于DNA对固相的亲和力。然而，这种方法不能对小于200个碱基对（bp）的DNA片段进行提取和纯化，但这是DNA的基本单位。
为什么对较小片段的灵敏度是必要的呢？
有文献报道，循环肿瘤DNA（ctDNA）或致病性DNA通常比cfDNA小。因此，对小于200bp的DNA片段的灵敏度可以更好地检测疾病。
一些比较新的技术，如液相萃取（LPE）、同位素萃取（ITP）和电动力学捕集DNA可以促进这种与尺寸无关的提取和纯化。然而，LPE是一种劳动密集型试验，而且非常耗时。
尽管ITP和电动捕集在提供快速和自动提取和检测病原体DNA（如结核杆菌（MTB））方面有很好的能力，但在选择性纯化短cfDNA片段方面还没有开始研究。
现在，在最近发表在Analytica Chimica Acta上的一项研究中，来自日本和美国的研究人员展示了一种新型的提取系统，它结合了ITP和电动力学捕获的优势。
在日本Shibaura Institute of Technology（SIT）的Nobuyuki Futai教授的领导下，该团队设计了一个开放的微流控系统，使用瞬时ITP来检测人类血浆样品中的结核杆菌。
这个毫米级微流控装置由可移动的凝胶门组成，可以精确提取不同的物种。它使用ITP进行DNA纯化，纯化的DNA会被凝胶条富集，并且可以轻松的用于后续PCR检测。
为了测试该装置的性能，研发团队使用该装置从加注的人类血浆中纯化和富集MTB基因组DNA片段。该微流控装置显示了高回收率、精确分离和对100-200bp的cfDNA片段的高灵敏度。
它还能纯化MTB DNA以进一步进行qPCR分析。对其分离能力的进一步调查显示，用蛋白酶K处理血浆会产生血浆肽。这些肽起到了内源性间隔分子的作用，提高了提取方法的分辨率。
这项可重构开放式微流控设备为PCR和深度测序等分析技术创建了一个多功能的样品制备平台。研发团队认为，他们的发现可用于开发先进的纯化系统，用于从血浆或血清中回收核酸。
大多数液态活检样品制备技术在DNA纯化过程中会使用标记染料，这往往会导致污染和qPCR信号水平的下降。
但在该设备当中不存在这个问题，活动门设计所产生的特定化学和筛分效果不仅确保了纯化DNA的出色回收，而且还消除了对标记染料的需求。这将使人们能够从少量的血样中准确诊断疾病和感染。
令人期待！
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参考文献

Futai N, Fukazawa Y, Kashiwagi T, et al. A modular and reconfigurable open-channel gated device for the electrokinetic extraction of cell-free DNA assays. Anal. Chim. Acta. 2022:339435. doi: 10.1016/j.aca.2022.339435

卡卡

癌症早筛产品属于非标产品，需求多样化赋予产品间差异性。液体活检的血液标志物主要包括CTC、ctDNA、外泌体、miRNA、肿瘤标志物蛋白等，如何通过液体活检捕捉这些信号成为液体活检技术的关键。从技术发展成熟度来看，NGS技术的出现使得ctDNA检测技术更加成熟，是目前液体活检的主流技术平台。从不同标志物的优势和侧重点来看，ctDNA点突变多应用于中晚期癌症的伴随诊断和用药指导；CTC在早期癌症患者血液中含量极低，且受限于细胞捕获技术，作为早筛标志物并不具备显著优势，更多应用于指导临床治疗和评估预后；ctDNA侧重基因层面信息的捕获，更适用于早期筛查。    肿瘤标志物在DNA层面的表现主要包括点突变、片段化、拷贝数变异、甲基化四种。从信号丰富度和信号强度的角度来看，（1）ctDNA片段化的信号丰富度很强但由于信号强度低，检测难度大；（2）ctDNA点突变信号强度比较高，但是信号丰富度较低，通常早期患者携带的与肿瘤相关的突变约为60个左右，而每个个体有约31.6亿个DNA碱基对可供突变，这些低频突变的准确识别对测序技术的敏感性要求非常高，难度极大；（3）ctDNA甲基化信号丰富度和信号强度均较高，是较为理想的检测标志物。     DNA甲基化几乎出现在所有癌症的癌前病变及癌症早期阶段，是癌症早筛的理想标志物。在人类基因组的2800万个CpG双核苷酸位点上，60-80%的胞嘧啶残基被甲基化修饰，成为癌症早筛中普遍而丰富的信号来源，而且DNA甲基化经常发生在肿瘤的形成过程中，肿瘤初期通常会发生抑癌基因甲基化水平升高或者原癌基因甲基化降低的现象，因此甲基化模式的改变是癌症早筛的理想指标。     和ctDNA点突变相比，ctDNA甲基化具有如下优势：（1）ctDNA甲基化是肿瘤早期发展的标志性改变，数量多、分布广：多数癌症在初期通常会发生抑癌基因甲基化水平升高或者原癌基因甲基化降低的现象，评估数千个CpG位点甲基化模式的改变增加了在给定血液样本中检测到ctDNA的可能性。（2）实现组织溯源：甲基化模式通常反映特定癌症的表观遗传起源，不同癌症细胞类型有独特的DNA甲基化“指纹”，肝癌、肠癌、胃癌的甲基化位点都不一样，器官特异性强，使肿瘤溯源成为可能。（3）在基因组上有“成簇”效应，增加信噪比：成簇分布的甲基化位点拥有更高的信噪比。（4）不容易被与自然衰老相关的克隆造血变异所混淆，与DNA测序错误有效分开：大多数正常cfDNA来自血细胞，由于克隆性造血积累了常见的与衰老相关的变异，类似于癌症变异，使用靶向突变方法检测点突变可能将这些变异与真正的癌细胞变异混淆，而这些与衰老相关的变异很少影响DNA甲基化位点，不需要进行额外的测序。    ctDNA甲基化作为癌症早筛检测标志物具有多重优势，是国内外早筛企业采用的主流检测指标。美国癌症早筛龙头Grail在CCGA-1子研究中将cfDNA突变、拷贝数变异（CNV）和cfDNA甲基化三种标志物进行对比，结果发现cfDNA甲基化在信号丰度、组织溯源等层面显著优于其他检测指标，其中靶向甲基化测序的LoD（检测下限）接近0.1%，能够有效捕捉来自肿瘤的信号。    多组学被称为“下一代液体活检”，是基于基因组、转录组、表观遗传组、蛋白质组等多个不同生命环节、不同维度的分子水平的大量生物数据，利用生物信息统计分析、计算生物以及机器学习等前沿技术，进一步提高早筛产品的检测性能。从国内外早筛企业采用的检测标志物来看，多数企业会结合多种指标或技术综合分析，包括ctDNA点突变、ctDNA片段化、ctDNA甲基化、蛋白质标志物、AI等。以美国泛癌种早筛企业Thrive Earlier Detection为例，公司早筛产品Cancer SEEK结合ctDNA突变和CTC（循环蛋白标志物）进行分析，再联合传统影像学筛查手段，可以将特异性提高至99.6%，最大程度减少假阳性结果。    市场上早筛产品参差不齐，甄选出真正有临床意义的早筛产品需要结合多个指标去判断，目前衡量肿瘤早检产品性能的指标主要包括敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。早筛产品的有效性指标：敏感性/特异性是基础，阳性/阴性预测值是关键。    敏感性和特异性是衡量早筛产品性能最重要的指标，业内比较青睐高敏感性、高特异性的产品。影像敏感性和特异性的因素也较多，在评估一个早筛产品的性能时，需要综合结合实验过程去判断，比如回顾性研究和前瞻性研究存在一定的差异，而提高检测频率可以提高敏感性，对阳性样本进行二次检测可以提高特异性。      敏感性和特异性不是同步变化的，控制特异性在较高的水平时，敏感性往往会下降，在比较一个特异性高、敏感性低和一个敏感性高、特异性低的产品时，可以用AUC（曲线下面积，综合特异性和敏感性两个指标）去评判，AUC越高的产品综合性能越好。PPV/NPV与敏感性、特异性和患病率均有关系。患病率越高，阳性预测值越高，说明在高危人群中进行检测比较有效，假阳性发生率较低，从而避免过度诊疗；患病率越低，阴性预测值越高，说明在平均风险人群中进行检测比较有效，假阴性发生率较低，从而避免漏检漏诊。PPV受特异性影响也较大，在患病率相同的情况下提高特异性比提高敏感性更有助于提高PPV。

感恩由您

ctc 的发展制约来之于检出率。ctc在循环系统内本就很少，而之前的采血方式，样本量少。检出率30%左右。顾意义不大。
新的技术cellcollect 采用静脉留置半小时。检出率已经很高了。。
ctDNA 局限性很大。化疗后取得的ctDNA很有可能化疗前的基因片段。不具备对疾病，如肿瘤负荷的实时反映。
如果取到ctc 再直接用ctc做DNA扩增。无疑是更理想的。

卡卡

据不完全统计，目前国内共 44 家做液体活检，其中 26 家使用 ctDNA 检测技术，9 家使用 CTC 技术。整体来看，ctDNA 技术用于肿瘤检测得到业内人士的广泛任何。
可以看一下CTC与cDNA优劣势对比：


另外，针对楼上 国内有哪些公司可以做液体活检？ 补充一个：
格致医学
目标人群：乳腺癌、卵巢癌、肺癌、全癌种，不同人群不同方案
对病人意义： 早期诊断、疗效评估、用药指导、复发动态监控

大力水手

谢邀。
液体活检是什么？
肿瘤患者血液中存在少量循环肿瘤细胞以及由坏死癌细胞释放的少量循环肿瘤 DNA。通过检测血液中的循环肿瘤细胞（CTC，cycle tumor cell）和循环肿瘤DNA（ctDNA，cycle tumor DNA）对患者肿瘤进行诊断与监测的方法被称为液体活检。在临床实践中,获得肿瘤患者组织样本只有手术活检和穿刺活检两种。相比于传统的活检方法,液体活检具有副作用小、操作简单、能重复取样等有点。
液体活检的发展历程：
液体活检包含了 CTC 与 ctDNA 技术 。
1、CTC技术的发展历程及现状
在 1896 年,澳大利亚学者 Ashworth 在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从 实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞,并率先提出了 CTCs 的概念。不过长时间以来 CTCs 的检测并未在肿瘤病人的防治中发挥应有的作用,主要原因就是检 测技术未取得突破性进展。从上世纪末以来 CTCs 检测技术得到了不断的改进,随 之带来的是 CTCs 检测在临床的应用。
1）第一代 CTC技术:CellSearch的发展历程
第一代 CTC 技术采用的是磁珠捕获法。能够捕获 CTC 的磁珠早在 1983 被 Immunicon 公司发明。其后 Immunicon 不断完善该技术并发展出了特定 CTC 染色技术。公司在 1993-2003 年完成一系列的临床实验后,其 CTC 检测系统 Cellsearch 于 2004年获得美国FDA批准用于转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺 癌临床检测。强生(Johnson&Johnson)下属子公司 Veridex 在 2008 年收购了 Immunicon 的 CTC 业务,并将其发展至今。CellSearch 系统是美国 FDA 批准的唯一临床用的 CTC 检测系统。该系统于 2012 年获得我国 CFDA 进口器械注册, 从而成为国内唯一用于临床的 CTC 检测系统。由于其在临床使用的唯一性, Cellsearch 系统是目前 CTC 检测的金标准。
　　图：CellSearch系统的发展历程
在临床检测中,标准操作是抽取患者7.5mL血液,通过 Cellsearch 系统检测其中 含有的CTC数量。临床数据表明,正常人和良性疾病患者CTC含量极少,而转移期患者根据其病情严重程度不同在血液中分布含有不同数量的 CTC。通过检测 CTC 的数量能够帮助医院判断患者的病情严重程度,并为此制订合适的治疗方案。
2）第二代：CTC检测技术前沿
为了提高 CTC 检测的灵敏度和发展对捕获CTC细胞进行后续分析的能力,在研的二代 CTC 检测采用了多种技术路线。与一代技术不同的是,二代CTC无论从技术还是市场方面均处于早期阶段。技术方面尚没有统一的标准, 许多公司采用不同的技术路线实现对CTC的捕获。目前还很难判断哪一种技术路线将成为行业标准。
2、ctDNA技术的发展历程及现状
1948年首次在人体血液中发现存在ctDNA。癌症患者的ctDNA则发现于 1977年。1994年发现肿瘤患者的 ctDNA 与其体内肿瘤细胞基因突变类似。直到 2000年以后,分子生物学与基因测序技术的发展使得 ctDNA 的突变检测技术不断成熟,相关研究也越来越多。
从当前研究角度将,ctDNA 在临床应用潜力非常广泛,主要涉及到肿瘤早期筛查、 肿瘤动态监测、耐药基因突变检测、评估肿瘤异质性及复发风险等作用。从已有的临床实验来看,ctDNA 的检测平台一般为二代基因测序与数字化PCR,适应症集中在非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、皮肤癌等常见肿瘤。 目前在国内市场，ctDNA已经开始应用于临床，索真基因在ctDNA检测技术的灵敏度上有较大的优势。
　　图：ctDNA的发展简史
临床意义：
1、液体活检可以解决临床取样的难点
临床上获取患者肿瘤组织样本只有手术活检及穿刺活检两种方法。转移期肿瘤患者体内可能有多个肿瘤病灶,具体到从哪个病灶获取肿瘤组织样本是一大问题。
　　图：液体活检能更全面获得患者体内肿瘤组织样本信息
临床研究表明,患者体内肿瘤细胞呈现很强的异质性,即肿瘤患者体内存在多种肿瘤细胞,不同肿瘤细胞的基因型不同,往往需要采用不同的治疗方案。在临床诊断上,获取患者体内肿瘤细胞的综合信息是精准医疗的基础。以图一为例,假设肾癌 患者体内有3个肿瘤病灶(1为原发位点,2、3为肺转移位点),不同位点之间的 肿瘤细胞基因型是不同的。无论穿刺活检获得哪个病灶的肿瘤组织,所得到的信息 都是片面的。但是每个病灶的肿瘤细胞或者肿瘤 DNA 都可能进入血液循环,通过 液体活检收集 CTC 或者 ctDNA 能够获得患者体内肿瘤基因或者蛋白表达的全面信息,能够更加精准的指导个性化用药。
2、液体活检可以实现对患者的早期诊断及高频监测
肿瘤细胞在药物作用下会自我进化从而产生抗药性。肿瘤细胞的基因变化是导致抗 药性的根本原因,临床上需要对患者体内肿瘤基因变化进行高频监测才能做到及时 准确用药。手术和穿刺活检一年内最多只能做 2-3次,尤其是重症患者往往还不能 进行手术或者穿刺。因此现有的临床采样技术不能满足高频检测的需求。但 CTC 和 ctDNA 通过简单的静脉抽血即可获得患者体内肿瘤细胞及 DNA 的信息,可以有 效的满足高频监测的需求。
　　图：液体活检能更全面获得患者体内肿瘤组织样本信息
上图表示的是非小细胞肺癌(NSCLC)的诊疗流程。在标准诊疗流程中,医生会 在手术及药物治疗前通过穿刺活检对患者肿瘤诊断与分型,在药物治疗之间依靠 CT、MRI 等影像学检测来判断患者是否应答。但是穿刺活检在检测频次上有较大的局限性,影像学检测判断药物有效性有较强的滞后性。液体活检有望改变未来的诊疗流程,通过不断的高频监测随时发现患者体内肿瘤的变化,提高医生用药的精准度。
3、液体活检可以减低医疗成本
根据美国 Medicare对肺癌穿刺活检开支分析,普通穿刺的开支为$8,869。约 20% 的穿刺活检会导致并发症,穿刺活检与并发症治疗的开支将达到$37,745。对医疗保险来说,平均每次穿刺活检的成本为$14,634。但一代 CTC 技术 Medicare报销额度为$369 , 二代 CTC 与 ctDNA 技术开支约在$800-1000。由于是抽血检测, 一般不会产生并发症。从成本的角度,医疗保险有较大的动力推动液体活检的 CTC 与 ctDNA 技术对穿刺活检技术的替代。
　　图：美国商业医保穿刺活检与液体活检的开支比较
评价：美国著名的肿瘤中心纪念斯隆-凯特林癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)主任医师兼首席医疗官约瑟·巴塞戈(Jose Baselga)称:“这(液体活检)可能永久改变活检方式,包括对治疗方案的响应、抗药性的出现,将来甚至还能用于早期诊断。”MIT Technology Review 杂志将”液体活检“列为2015年度十大突破技术。美国《临床癌症进展(Clinical Cancer Advance)》报告中也认为液体活检技术在今后十年有望得到广泛应用。

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