实验技能 | 第二期：常见核酸（RNA）提取和纯化的方法

笑看风云

众所周知，核酸分为DNA和RNA，广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。在《实验技能 | 第一期：常见核酸（DNA）提取和纯化的方法》已经详细介绍DNA提取和纯化的方法。这期主要介绍RNA提取和纯化的方法，为大家在分子生物学实验中打下坚实基础，同时也是后续的克隆、PCR、QPCR、建库测序等实验奠定基础。有不清楚的可以在评论区分享或添加小编微信私聊！！！


01 为什么要介绍RNA提取和纯化

RNA提取是分子生物学中的一个重要步骤它是从细胞或组织中提取RNA的过程。RNA提取的目的是为了进一步分析RNA的组成、结构和功能，以便研究RNA在生物体内的作用和意义，本文将介绍RNA提取的流程和方法。RNA提取的基本原理是利用化学试剂将RNA从细胞或组织中分离出来，RNA的分离过程需要破坏细胞膜和核壁，使RNA从细胞中释放出来。此外，还需要去除DNA、蛋白质等杂质，使提取到的RNA纯度尽可能高。在普通PCR、QPCR、建库测序等实验，包括Nothem杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。RNA根据功能的不同分为核糖体RNA(rRNA)，信使RNA（mRNA）和转移RNA（tRNA）。其中rRNA的数量最多，占总量的80%~85%，tRNA及核内小分子RNA占15%~20%；mRNA仅占1%~5%。又根据各种RNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已经比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。
02 RNA提取类型

2.1 总RNA提取：总RNA中，75-85%为rRNA（主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。
2.2 miRNA提取：MicroRNAs（miRNAs）是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs（siRNAs），通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
03 RNA样本类型




详细介绍可参考《实验技能 | 第一期：常见核酸（DNA）提取和纯化的方法》！！！

04 RNA采样、提取纯化、保存流程

4.1 RNA提取和保存条件
RNA为单链分子，稳定性差，极易降解，降解的主要原因是内源性核酸酶 (ribonucleaseRNAase)的作用，它在活体内的存在时间也不长。然而外源性RNA酶也不容忽略，头发、灰尘、体液、塑料等均有RNA酶的存在。因此RNA的保存需极其谨慎，提取时应该戴帽子、口罩、橡胶无菌手套，并在洁净、灰尘少的地方提取。从组织材料的采集开始，经运输与储存包括实验的全过程，涉及到RNA的均需将其处于液氮中，该温度下细胞生理生化过程近平停止，方能较长时间保存。这意味着不仅组织材料需保存于液氮中，实验操作也需保证液氮充足供应。将样品保存于-80°C等均无法制止RNA的局部或完全降解。4.2 常见样本保存条件4.2.1 储存温度对样本的影响
生物样本的长期储存，通常使用尽可能低的温度来降低样本内的生化反应，以提高样本内各种成分的稳定性。生物大分子、细胞、组织和器官的常用储存温度为-80°C（超低温冰箱）、-140°C（液氮气相或深冷冰箱）及-196°C（液氮液相），温度越低样本的稳定保存时间越长。不同温度对生物样本的影响和保护作用
a. -60°C~0°C储存：此温度是水的结晶温度，容易对细胞和组织的微观结构造成损害，一般不使用这一温度来保存组织和细胞。且在组织样本内生物大分子受到细胞组织内多种因素的影响，稳定性有可能明显降低，所以通常样本库不使用-60°C~0°C作为储存温度。
b. -80°C储存：-80°C是较常用的样本保存温度，也是常用超低温冰箱所能达到的温度。基于操作简便性、储存量和成本等因素来考量，这一温度也是目前保存样本中生物大分子活性的常用温度。但对不同的生物大分子活性来说，这一温度下到底能保持多久的问题仍然处于研究探索中。组织中 DNA 的稳定性较好，可以在-80°C下保持数年或更长时间。但 RNA 则容易被广泛分布于细胞和各种组织里的 RNA酶降解。RNA 在稳定剂中的储存时间一般不超过5年。所以，长期保存 RNA 活性，建议使用更低的温度，或者利用小部分样本提取 RNA与剩余样本同步储存。其他样本内的蛋白质和脂类等生物大分子在-80°C下也能保存，但时间长短不一，稳定性逐渐衰减。另外，目前常见的大型自动化样本存储设备只能和-80°C超低温设备配套使用，尚不能够和液氮设备配套使用。
c. -140°C储存：-140°C是低于水的玻璃化温度（-136°C），也是气相液氮罐和深冷冰箱所能达到的温度，样本在这一低温范围内生物学活动极大降低，是保存样本中细胞活性的理想温度。深冷冰箱是电制冷，无需液氮，装满样本后的稳定温度通常在-140°C以下，和使用气相液氮罐相比，其优势在于不需频繁添加液氮，维护方便。但电制冷的降温速度低于液氮，一旦开启容器取放样本时容易造成较大范围的温度波动，温度恢复时间也相对较长，因而更适合较少开启取放样本的情况。另外，电制冷冰箱必须保障供电，在断电情况下推荐使用液氮设备以提供备份储存。
d. -196°C储存：-196°C是液氮挥发的温度，所以只有液氮液相保存技术能达到此温度。样本内的生理、生化活动在此温度下基本停止，稳定性状的样本可以得到长期保存。液氮保存是长期保存样本内细胞活性、组织器官的复杂结构及活性的最有效方法，已广为接受与认可。与其他不同温度冷冻模式相比，液氮容器液相储存样本需要做好防护样本间的交叉污染。
4.3 RNA样本采集
4.3.1 植物样本
a. 根据实验目的选择样本相关区域，优选幼嫩新鲜的样本组织可获取较多的核酸；
b. 植物样品：采集时建议用RNase free水擦拭样本后用吸水纸吸干，尤其对于野外样品；
c. 组织样品的分离尽量在冰上快速进行，减少RNA降解。然后迅速放入已做好标记的50 mL离心管或封口袋中（根据样本大小和数量也可用1.5 mL和2 mL EP管），液氮速冻后用封口膜密封，-80℃保存或用大体积干冰进行送样；
d. 植物纤维含量较高，应采集尽可能多的样本并备份（1-2份）以防备重新取材；
e. 不建议植物组织样本使用RNAlater等RNA保护剂保存，因为植物细胞壁的存在，试剂较难渗透到细胞中。


4.3.2 动物样本：
a. 活体取材后的组织用RNase-free的0.9%生理盐水冲洗，去除血渍和污物，并剔除非研究所需的组织，吸干水渍并切小块（厚度小于5 mm厚约为50 mg左右的小块），放入已标记好1.5 mL 或者 2.0 mL的RNase-free EP管中，迅速液氮冷冻后用封口膜封口，再将EP管放置于50 mL离心管中或封口袋中，-80℃冰箱保存或用大体积干冰运输；
b. 动物组织中内源性核酸酶含量丰富，所以样本采集应越快越好，样品分割的时候最好在冰上快速进行，并及时做好备份（1-2份）
c. 一般情况下，RNA保护剂对于动物类样本都可使用，比如小体积的昆虫类组织，如寄生蜂、螨等，RNA保护剂的使用参照试剂说明书。


4.3.3 菌类样本
4.3.3.1 液体培养基：挑取单菌落于 50 mL 液体培养基中，适宜温度培养过夜，在对数生长期（OD值为0.6-0.8）采集菌体。采集适量菌液转入合适的离心管中，高速离心收集菌体，弃去上层培养基，液氮速冻后用封口膜封口。若菌体离心管为 1.5-2 mL 的小量程，建议在外层套上50 mL的大离心管，以防止小管子冻裂菌体被污染。-80℃冰箱保存或用大体积干冰运输送样。
4.3.1.2 固体或半固体培养基：平板培养的微生物，在菌体生产最旺盛时期用灭菌后的勺子在平板中刮下，置于1.5或2.0 mL的离心管中，迅速液氮速冻，建议在外层套上50 mL的大离心管，以防止小管子冻裂菌体被污染。-80℃冰箱保存或用大体积干冰运输，在收集菌体时不要刮到培养物。
注意：
a. 为保证实验的顺利，样品同样建议备份1-2份，以防备部分样本降解重新取样、制备和送样；
b. 菌体类样本不建议用RNAlater保存，因为RNAlater密度较大，后续提取菌体不易分离；
c. 菌体类样本不建议用TRIzol保存，大部分菌类样品使用TRIzol法提取不成功。
4.3.4 细胞样本
4.3.4.1 贴壁细胞：
a. 贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液，贴壁细胞用PBS缓冲液快速洗一次；
b. 按每10 cm2 培养面积（相当于六孔板一个孔或35 mm直径培养皿）加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 试剂；
c. 用1 mL 枪头反复吹打，使 TRIzol 与细胞充分接触并消化；
d. 将上述溶液转移到 RNase-free 的试管中（1.5或2 mL离心管），用一次性注射器反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，使溶液呈现清亮且不粘稠的状态；
e. 液氮速冻后放入干冰或于-80 ℃冰箱中保存。
4.3.4.2 悬浮细胞：
a. 悬浮细胞培养或处理结束后，离心收集细胞，去除培养液；
b. 保留的细胞用 PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去 PBS 缓冲液；
c. 按照每 1×106 - 5×106个细胞加 1 mL TRIzol 的比例加入 TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复吹打直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮且不粘稠的状态；
d. 液氮速冻后放入干冰或-80 ℃冰箱中保存。
4.3.5 血液样本
4.3.5.1 全血：全血类样本即是不区分血细胞、血浆和血清等成份，最终获取的RNA是样本的总RNA，对于这类样本有两种采集办法：
a. TRIzol法：
（1）取一个15 mL管，加入6 mL TRIzol和2 mL新鲜血液（比例为3:1），用移液器吹打多次帮助裂解样品中的细胞。
（2）样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解；
（3）室温孵育5 min让核蛋白完全分解；
（4）编写记号，封口膜密封，液氮速冻，80 ℃冰箱中保存，干冰送样。
注：冰冻血液溶解过程中破碎的细胞会释放RNA酶，引起 RNA降解，因此此类样品要求在冰冻前进行分装，避免再次溶解分装造成RNA降解。


b. PAXgene RNA tμbe法（人血样本推荐）：采用BD管采集（全血RNA管）血液2 mL（BD管容量为2.5 mL）后进行保存，操作方法见产品说明书。采用Qiagen专用试剂盒提取RNA（PAXgene Blood miRNA Kit）进行提取。
4.3.5.2 血细胞：以哺乳动物采集白细胞或者其他有核细胞进行后续实验，方法如下：
a. 在已加入抗凝剂（因肝素会影响下游建库测序，建议选用EDTA类抗凝剂）的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀；
b. 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），20℃，3000 g离心30 min；
c. 用移液器小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清；
d. 加入白细胞20倍体积的TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；
e. 液氮速冻后放入干冰或-80 ℃冰箱中保存。
注：非哺乳动物可直接寄送加有抗凝剂（因肝素会影响下游建库测序，请选用除肝素外的其它抗凝剂）后液氮速冻的的全血样本。
4.3.5.3 血清样本
a. 用医用血清管收集全血或旋盖管收集全血样本，上下轻轻颠倒混匀后，立即将全血置于4℃或冰盒中正立放置3-4小时，可见血块析出（也可放置4℃冰箱过夜）；
b. 5000 rpm，4℃离心10 min离心分离得到上层血清样本，取出上清后可再3000 rpm，4℃离心10 min保证血清质量（血样需在1 h内进行血清分离，依据血清管操作说明或实验室血清分离步骤进行操作）；
c. 将上清转移至1.5 mL旋盖尖底离心管中（RNase free），每个管子吸入200 μL血清进行分装，弃去血细胞沉淀；
d. 将分装好的血清置于-80℃长期保存；
注：送样量最好4 mL以上，注意血液若发生溶血现象不建议使用（血细胞破裂后细胞中RNA进入血清中）。
4.3.5.4 血浆样本
a. 用加有抗凝剂（因肝素会影响下游建库测序，建议使用EDTA类抗凝血剂）的旋盖管收集全血样本；
b. 下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置3-4 h，5000 rmp，4℃离心5 min，取上清即为血浆（血样需在1 h内进行血浆分离，依据抗凝管操作说明或实验室血浆分离步骤进行操作）；
c. 将上浆转移至1.5 mL旋盖尖底离心管（RNase free）中，每个管子吸入200 μl血浆进行分装，弃去血细胞沉淀；
d. 将分装好的血浆置于-80°C长期保存；
4.4 RNA样本保存
选择储存温度应考虑样本的类型、预期储存的时间、样本中生物分子的特性、不同细胞的特性。细菌和细胞的活性临界温度通常认为是-140°C，在这个温度下，所有的代谢活动都停止，对于能承受在此温度下保存的样本，建议选择低于这个温度进行储存，利于长期稳定的储存。一些样本不能承受这么低的温度，它们的储存温度一般选择-80°C，在此温度下，代谢活动并没有完全停止。另外，一些经过特殊处理的样本，则可在低温和室温条件下储存。
a. 固体组织样本的储存温度：
长期储存的新鲜冰冻组织和 OCT包埋冰冻组织应储存于液氮中，冰冻组织切片或者用于DNA 和 RNA 提取的冰冻组织应储存在-80°C。经过福尔马林固定的石蜡包埋组织及组织切片应储存在室温，在低于 27°C的环境下，并控制虫患和湿度。
b. 液体样本的储存温度：
对于液体样本，包括血液和尿液，样本里的各种成分应在储存前分离，使得每一种成分能够在最佳条件下储存。全血、血清、血凝块、非淋巴细胞和血浆样本应储存在-80°C。血沉棕黄层和白细胞应储存在液氮中。尿液应储存在-80°C或者液氮中。
c. 细胞的储存温度：
长期保存的细胞系应储存在液氮中。气相液氮比液相液氮储存样本更好。虽然液相液氮的温度更低一些（-196°C），但气相液氮的温度（-150°C）仍在临界温度之下。对于需要但没有条件使用液氮保存的细胞样本，应至少储存-80°C环境中。
4.5 样本的冻存和取用
样本储存在稳定的条件下，应避免反复冻融。样本反复冻融会加快生物大分子物质的降解，严重影响样本的质量。样本在冻存前，最好分装成小份样本再储存，可以避免不必要的反复冻融。
05 RNA提取流程

1. 细胞或组织的收集：RNA提取的第一步是从生物样品中收集细胞或组织。不同的样品类型需要采用不同的方法进行收集，例如，从培养细胞中提取RNA可以直接收集细胞，而从动物组织中提取RNA则需要将组织切碎并加入一定量的缓冲液中。
2. 裂解细胞：细胞或组织收集后，需要使用化学试剂裂解细胞，使RNA从细胞中释放出来，裂解细胞的试剂可以是蛋白酶、盐酸等。
3. 去除DNA：RNA提取过程中会出现DNA污染，因此需要使用DNA酶将DNA降解掉。此外，还可以使用DNA特异性的硅胶柱对RNA进行纯化，避免DNA的污染。
4. 去除蛋白质：RNA提取后，还需要去除蛋白质等杂质，可以使用酚/氯仿等有机试剂将RNA和蛋白质分离开来。5. 沉淀RNA：RNA经过纯化后，需要进行沉淀。可以使用乙醇或异丙醇等有机试剂沉淀RNA。
6. 洗涤RNA：沉淀后的RNA需要进行洗涤，以去除杂质。可以使用乙醇或异丙醇等有机试剂进行洗涤。
7. 溶解RNA：最后一步是将RNA溶解在缓冲液中。RNA的缓冲液可以是TE缓冲液、Tris-HCI缓冲液等。
06 RNA样本裂解、原理及优缺点

6.1 TRIZol法（酚/氯仿法）：
TRIZol试剂中的主要成分为异硫氰酸肌和苯酚，其中异硫氰酸肌可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开水相层(无色)主要为RNA，有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。TRIZol法是RNA提取中最常用的方法之一。该方法通过酚的提取和氯仿的萃取，将RNA和蛋白质分离开来。该方法提取出的RNA纯度高，但过程复杂。


预防RNase污染注意事项：
a. 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
b. 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
c. RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
d. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。
6.2 硅胶柱法：
硅胶柱法是一种高效的RNA提取方法。该方法利用硅胶柱对RNA进行纯化，可以避免DNA的污染。该方法提取出的RNA纯度高，但成本较高。
6.3 离心管法：
离心管法是一种简单易行的RNA提取方法。该方法利用离心管在高速离心时，RNA会沉淀在管底，可以通过吸管将RNA吸走。该方法不需要昂贵的硅胶柱，但提取出的RNA纯度较低。
6.4 磁珠法：可参考《实验技能 | 第一期：常见核酸（DNA）提取和纯化的方法》。
07 RNA检测与产物保存

7.1 浓度检测

7.1.1 紫外分光光度计进行测量

• 检测原理：核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，最大吸收波长是260nm。
  
• 优点：操作简便、迅速。缺点：无法区分DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其他杂质，易得到浓度虚高值。
  
• 常见仪器：Nanodrop、Onedrop。
  

7.1.2 Qubit荧光计进行测量

• 检测原理：采用荧光染料与特异的靶分子结合后发出荧光，仪器接收荧光值转化为浓度数据。
  
• 优点：灵敏度较高，操作简便。
  
• 缺点：成本高，价格较贵；无法直接区分降解核酸。
  

7.2 纯度检测

7.2.1 紫外分光光度计进行测量

• OD260：核酸的吸光度；
  
• OD280：蛋白质的吸光度；
  
• OD260/OD280 =1.7-1.9 说明纯度很好；
  
• OD260/OD280 <1.7 表明可能有蛋白质残留；
  
• OD260/OD280 >1.9 表明DNA可能存在部分降解，建议进行完整度检测或存在RNA残留；
  

7.2.2 琼脂糖凝胶：判断有无RNA、蛋白残留。1%-2%琼脂糖，上样1-3ul。



7.3 完整性检测

采用Agilent 2100生物分析仪检测，下游应用为RT-qPCR时，一般认为Rin≥5，说明RNA完整性良好；Rin≥8，说明RNA完整性较为完美。



7.4 RNA产物保存
1. 可以放在1.5mL EP管中加1mL 75%乙醇，-80℃保存。大约可保存1年。
2. 一般未纯化的RNA直接在－80℃放置2周会有明显的降解。
3. 组织或细胞沉淀可直接冻于-80℃冰箱。
4. 细胞可在TRIzol里冻存在-80℃冰箱；组织加TRIzol，匀浆后，可冻于-80℃冰箱至少保存1个月；
5. RNA沉淀保存于75％乙醇中，2-8℃可保存1周，或-20℃中 可保存1年以上；
6. 提纯并溶于DEPC水中的RNA分装保存于-80℃冰箱中。
08 常见问题

Q1：RNA效率低有以下几种原因：
a：样品裂解或匀浆处理不彻底；
b：最后得到地RNA沉淀未完全溶解；
c：样品匀浆时加的TRIzol过少；
d：匀浆样品后未在室温下放至５分钟；
e：吸取水相时混有有机相；
f：RNA沉淀未完全溶解等。
Q2：A260/A280＜1.65原因：
a：检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高；
b：样品匀浆时加地试剂量太少；
c：匀浆后样品未在室温放置2分钟；
d：水相中混有有机相；
e：最后得到地RNA沉淀未完全溶解；
Q3：RNA降解原因：
a：组织取出后没有马上处理或冷冻；
b：样品或提取地RNA沉淀保存于-5℃-20℃，未在-60℃-70℃保存；
c：细胞在胰酶处理时被破坏；
d：溶液或离心管未经RBase去处理；
09 温馨提醒

1）在进行RNA提取实验时，使用独立的RNA提取专用试验台；
2）实验过程中穿好实验服，佩戴一次性灭菌手套，佩戴口罩，避免讲话交流等，防止您的唾液和汗液中的RNaes酶污染实验；
3）实验过程中尽量使用一次性灭菌灭酶的塑料器皿，若不得不使用玻璃器皿，可以选择使用0.1%的DEPC水浸泡处理24 h后再高压灭菌去除DEPC，也可以使用干热灭菌法进行灭菌；
4）RNA提取实验中使用的所有器具及耗材都建议专门使用，并建议耗材设立一个独立的区域存放，不与其他实验混用；
5）RNA提取实验中所用的试剂也应专用，不与其他实验混用，所用的无菌水需要使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
                                                                      ----The End----

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/660142017