干货分享 | PCR技术的常规实验流程步骤

莺歌燕舞

PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，现在已经被广泛运用于临床和实验室，用于扩增特定的DNA片段。它的基本原理就是在体外模拟细胞内DNA复制的条件，最终完成特定基因的体外复制。PCR实验基本由变性、退火、延伸三个步骤完成。
1.变性。变性的目的是使模板DNA双链解旋成为单链以便与引物结合，通常给它加温至95℃（这是Taq酶进行30个左右的循环后活力不致受到过多损失时能耐受的最高温度）。模板的完全变性对PCR成功与否至关重要，第一轮循环中变性时间往往为10min，然而根据经验，在其他各次的循环中一般以95℃持续30s（变性时间过长会损害酶活性）足以使各种模板完全变性。当模板的G+C含量超过55%时则需要更高的变性温度，可以选用来源于古细菌的DNA聚合酶，因为它比Taq酶更能耐受高温。
2.退火。模板变性成单链后，温度快速降至退火温度，引物与模板DNA单链的互补序列可发生结合。退火温度的选择也至关重要，如果退火温度太高，那么引物就无法与模板很好地结合，进而就会影响扩增效率；如果退火温度太低，引物则会产生非特异性结合，从而导致非特异性DNA片段的扩增。退火30-60s便可使引物与模板之间完全结合。
3.延伸。模板-引物结合物在Taq酶的作用下，沿着5’→3’的方向合成一条与模板DNA链互补的链。延伸时的温度通常为72℃（Taq酶的最适温度为72℃-78℃）。在最适温度下，Taq酶的聚合速率约为2000bp/min。不过靶基因的每1000bp的扩增产物的延伸时间的设计时长为1min。另外，延伸时间随扩增片段长短而定，甚至在所扩增目的基因的长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。
重复循环“变性→退火→延伸”过程就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。在最后一个循环后，反应在72℃维持5-10min可使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

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