流式细胞术—荧光染料对应流式检测通道

病理医师

在操作流式细胞术检测的过程中，经常会遇到同学这样要求：荧光素在我们的仪器上用FL4通道接收，你也必须用FL4通道接收” 或者“老师我按照文献进行了多色实验的搭配，你为什么不用文献中的通道给我检测？”。每当遇到这种情况的时候，常常感觉…… 。

相同的荧光素在不同的仪器上是否用相同的接收通道？

下图解释了相同的荧光素在不同仪器上的接收通道的问题。如APC在CytoFLEX以及FACSAriaII上用FL6接收，但FACSCalibur 用FL4通道接收，在Moflo XDP上用FL9通道接收。因此，不同的仪器具有不同的设置，接收荧光素的通道可能存在不同。



为了确定荧光素的接收通道，我们应该掌握仪器光学系统及荧光素的相关信息

(一)流式细胞仪器的光学系统（激光光源与光学系统）

（1）激光光源：激光光源的光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm 即短轴稍大于细胞直径的光斑[1]。椭圆形光斑激光能量属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处[1]。现有流式细胞仪配备的激光器种类主要为488nm、638nm、561nm和405nm，也有355nm或者375nm、532nm和808nm等。有的流式细胞仪只配备488nm；有的流式细胞仪配备两种激光器如488nm与638nm。为了扩展流式多色检测能力，有些流式细胞仪同时配备488nm、638nm和561nm等。根据个人实验设计需要可以定制我们仪器激光器的种类。

2）光学系统：流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、滤光片与分光镜等光学元件组成，他们分别将不同波长的光信号引导到不同的探测器。

流式细胞仪主要的光学元件为滤光片，主要分为长通滤光片（long-pass filter, LP）、短通滤光片（short-pass filter SL）、带通滤光片（band-pass filter, BP）

长通滤光片( Long pass Filters)

允许特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过。如LP500滤光片，允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光则被反射回，如下图。


短通滤光片( Short pass Filters )

与长通滤光片相反，使特定波长以下的光通过，特定波长以上的光则返回。如SP500短通滤光片，允许500nm以下的光通过，而500nm以上的光则被反射回，如下图。



带通滤光片(Band pass Filters )

允许一个固定范围内波长的光通过。如BP500/50表示允许波长475nm-525nm范围的光通过，而不允许通过大于525nm或者小于475nm的光，如下图


流式细胞仪每种激光器对应激光器特定的接收通道，如下图以CytoFLEX 仪器为例，具备3激光（488nm、638nm和405nm）和13色（13个荧光接收通道）检测能力，488nm激光器对应5个荧光接收通道， 638nm的激光器对应3种荧光接收通道，而405nm的激光器对应5种荧光接收通道，其中BP为带通滤光片的简写


（二）确定所用荧光素的最大的激发波长与最大的发射波长

荧光素自身存在斯托克斯位移（Stoke’s shift），即荧光素的发射光谱与吸收光谱存在不重叠的现象，下图以7AAD荧光素为例，虚线为激发光谱，实线为发射光谱。



荧光素有其自身的最大吸收与发射光谱。比如下图常用荧光染料FITC，最大吸收光谱为490nm左右， 最大的发射光谱为520nm左右。流式细胞仪根据荧光素的最大吸收光谱确定该荧光素在流式细胞仪上由那种激光器激发，并根据最大发射波长确定其接收通道。因此对于FITC，根据其最大吸收波长选择该荧光素由488nm的激光器激发，根据其最大的发射波长520nm，确定该荧光素应该在带通滤光片525/40的通道上接收。



FTIC为一类最大吸收波长单一的荧光素，我们很容易确定其激光器激发波长，但像PE-CY7该类荧光染料，其最大的吸收光谱在561nm左右。目前，561nm的激光器并非仪器的标准配置，是不是没有561nm的激光器，该荧光素就不能被激发？答案是否定的。我们仔细观察下图，发现该荧光素还有第二最大吸收峰（大约在488nm左右），因此没有配置561nm激光器的仪器，我们也可以488nm的激光器替代561nm的激光器。



对于常用的荧光素，抗体说明书或者网上很容易查找到其最大的吸收波长与发射波长。但一些不常用的荧光素，我们可以通过网上的“荧光光谱查看器”查看其荧光素的激发波长与发射波长,以下查询网址供参考

Thermofisher官网: https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
BD官网：http://www.bdbiosciences.com/cn/s/spectrumviewer
Biolegend 官网：http://www.biolegend.com/spectraanalyzer

能否根据文献中提供的抗体的配色方案购买荧光抗体？

对以上知识有一定理解后，我们的答案是否定的。参考文献使用的抗体及所配的荧光素对我们的实验设计具有一定的提示作用，但我们实验具体所用的荧光素还需要根据所用仪器的激光器种类及接收通道的类型进行配置。如现有流式细胞仪只有488nm一根激光器，而参考文献选用了FITC、PE、APC的荧光素，那么APC荧光素在已有仪器上是检测不到的，这是因为APC需要638nm的激光器进行激发，所以造成该荧光抗体无法使用，造成浪费。

进行多色配色方案设计时荧光素选择的建议

（1）确认所用流式细胞仪上激光器种类及每个激光器对应的通道数（主要是带通滤光片的类型）。
（2）根据抗体的表达的强弱及染色指数选择合适亮度的荧光素。
（3）根据荧光素的光谱的重叠程度，选择光谱重叠小的荧光素

资料参考
[1]王书奎, 周振英. 实用流式细胞术彩色图谱[M]. 第二军医大学出版社, 2004
文章来源：微信公众号 流式小助手

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