全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。

幸福侠侣

上上期，我在自己的公众号推出了Western blot(WB)最全避雷手册，反响不错。


同时，有人在公众号后台私信我，说他(她)的朋友最近被WB烦的不行，希望能够再出几期，解答他们在WB中遇到的难题。



个人思考后觉得，应该从WB原理开始，一步一步捋下来，所谓知其然而知其所以然。
让我们红尘作伴，共同努力，驾驭WB实验。



Western blot可大致分为以下7步，分别是蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、电转印、封闭、抗原-抗体免疫反应、蛋白检测。
为此，我将从头到尾剖析WB原理，希望为大家答疑一二。


<hr/>WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。

一、蛋白提取
常规的样品无外乎3种，分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解，细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来，随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton   X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。同时，裂解液中还包含其它成分，如Tris-Hcl作为缓冲剂，可防止蛋白在提取过程中变性；以及Nacl，可防止提取的蛋白由于非特异性的聚集而形成聚体等。不同公司生产的裂解液成分大同小异，多是以上成分按不同比例组成，可分为弱、中、强三种不同裂解能力的裂解液。
最重要的是我们要清楚自己研究的蛋白到底在细胞哪里表达，是细胞膜、胞浆还是细胞核。这决定我们该使用哪种强度的裂解液。如果裂解不充分，我们抽提的总蛋白中可能已经不包括目标蛋白或目标蛋白随着沉淀物被丢弃，那么整个WB实验从一开始就悄无声息地失败了。

二、蛋白定量
为什么要蛋白定量？首先要知道WB的目的是什么。WB是要比较同样细胞数量的细胞或同等重量的动物组织中目的蛋白的表达量高低变化。那么首先，我们需要控制样品本身重量大小或细胞数量的多少对实验结果的影响，故不同组间的样本需要控制一致才能提取蛋白。因此，在第一步中提取的蛋白上清液即是同等质量下，同样提取方法下，抽提的总蛋白混合物，这里面包含了各种各样的蛋白。我们必须知道这个上清液中的总蛋白浓度，才能在第三步电泳时保证每一个上样孔中加入的总蛋白质量一致，这样后面对条带上的蛋白定量分析才是有意义的。
我们怎样才能知道这个上清液中，总蛋白的浓度呢？目前有4种方法，分别是双缩脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。较常用的是BCA法，其原理：蛋白质可在碱性环境下将2价铜离子还原为1价铜离子，而1价铜离子可以与BCA试剂发生颜色反应，2分子的BCA螯合后可形成紫色的复合物，这种复合物具有非常好的吸光性(用OD值反应)。在562nm的紫外光下，溶液中复合物的OD值与蛋白浓度在一定范围内呈现良好的线性关系。我们可以通过这种线性关系大致地计算出自己的样品中总蛋白浓度。
自然而然，我们需要一个OD值-蛋白浓度标准曲线。购买商用的蛋白标准品(即包含已知浓度的蛋白溶液)，一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三种。首先，按照(铜离子体积：BCA   regent体积=1：50)配制BCA工作液。准备好4mg/ml蛋白标准品，使用去离子水倍比稀释蛋白标准品，最后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8个不同浓度的蛋白溶液，单位μg/μl。随后将自己的要测的样品按照一定倍数稀释(因为待测样品的蛋白浓度肯定是过高而超过BCA检测的线性范围，稀释倍数根据样本类型和经验来定)。采用96孔板，每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待测样品(一个孔一个样品，如待测样品数量为15，则一共使用标准蛋白梯度浓度的8个孔+15=23个孔，个人建议每个孔做2个复孔，防止加样误差)。随后放入37℃孵育箱，孵育30min，促使发生紫色螯合反应。孵育结束后立刻拿到酶标仪中，在562nm光下，测算每一个孔的OD值，并通过标准蛋白梯度浓度和其相应的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白浓度线性公式(R方值建议0.99以或以上)；同时根据待测样品的OD值和上述公式计算出每一份样品中总蛋白的浓度。
定量好的蛋白根据体积比例加入5X或者1X的蛋白上样缓冲液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分变性，解除二级或三级结构，只保留一级链式结构。上样缓冲液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的负电荷，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异；DTT还原剂，可打开巯基维持单链的线性结构；甘油，可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部，不会逸散至加样孔以外；溴酚蓝为小分子蓝色物质，有指示作用。
三、SDS-PAGE电泳
终于到了电泳时刻。电泳是为了使得我们的加样孔中同等质量的总蛋白在相同电场作用下，从配置好的凝胶中由上往下迁移。我们都学过物理，知道带电物体在电场中移动距离与物体本身的电荷、物体的质量相关。蛋白质本身的电荷、质量、结构是不同的，这些都是影响蛋白在凝胶中移动的因素。通过煮沸，我们消除让蛋白仅保留了一级结构；上一步添加的上样缓冲液中SDS消除蛋白质本身电荷的差异。那么此时，上样的总蛋白中各种各样蛋白在凝胶中的迁移距离只与蛋白的质量相关。电泳时，整个凝胶处在一个大致呈“U”型的电场中，因此市场能看到电场强度过高时，整条溴酚蓝呈现微笑的形状。
借助电泳时的电场力作用，首先总蛋白在较小电压下移动到浓缩胶和分离胶的交界处，此时见溴酚蓝呈现一条笔直的蓝线；随后，在高电压的作用下，所有孔道中的蛋白会同时开始向下迁移，一定时间后，总蛋白中各种蛋白会在分离胶中的不同位置中分离开，分离后蛋白所处的水平位置只与蛋白分子量大小有关。分子量大的蛋白靠上，而分子量小的蛋白靠下，溴酚蓝则在最下面的位置。每一种分子量的蛋白会在分离胶中形成一条直线，当然我们是看不见这条线的，这也是为什么我们要加溴酚蓝的目的，溴酚蓝刚好跑出最下方玻璃板时，电泳就可以停止了，否则你关注的小分子量蛋白可能会跑出胶外。我们可以通过彩色的Marker来大致地确定目标蛋白在哪里。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。
四、电转印
电转印就是将凝胶中的蛋白，转移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。这两种膜表面都有肉眼不可见的小孔，都可以用来电转印。NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合；PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜，使用前需用无水甲醇活化(膜表面的正电基团可被无水甲醇活化)，易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白电转印。

电转时，电场是垂直于我们的凝胶和膜的。因此凝胶中的蛋白质再次在电场作用下向紧贴着凝胶的膜上转移，并最终被吸附在膜的表面。我们可以通过丽春红染色大致地评价电转印的情况(丽春红可将膜上调的蛋白染成红色，而膜其它位置基本不着色)，但是丽春红染色仅仅是粗糙的评价方法，并不是我们的目标蛋白是否转移到膜上的直接证据，做＞150KD分子量蛋白的同志们尤其得注意。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。

五、封闭
一旦电转印结束，我们就开始了封闭的过程，常采用5%、8%的脱脂奶粉或胎牛血清，室温下，摇床孵育膜1h。常规采用奶粉即可，但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白时必须使用胎牛血清封闭，因为奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失，同时也可能出现较高背景。
为什么要封闭呢？我们知道，电转后蛋白质已迁移至膜的表面，此时膜上还存在大量的、未吸附蛋白质的小孔。此时我们采用牛奶或胎牛血清封闭，其中包含大量的蛋白质，这些蛋白质会吸附在那些小孔上，堵住这些孔。如果没有封闭，那么在下一步我们添加的一抗将同时吸附在目标蛋白和膜表面其它位置，且很难洗掉，最终ECL发光检测时可出现非特异性条带、杂带、高背景等等，浪费抗体不说，还会影响最终的判断。当然，这些奶粉中的蛋白也会一定程度地吸附到目标蛋白表面，但是抗原-抗体特异性反应相比，这种非特异性的结合会很轻松的在后面漂洗步骤中消除。

有时候也会遇到未封闭，但没有出现杂带。对此，我只想说，常在河边走，哪有不湿鞋啊。

六、抗原-抗体免疫反应
这一步是比较简单的。就是你购买的特异性抗体与你的目标蛋白发生抗原-抗体特异性免疫反应。首先是一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合，而膜表面其它位置的孔因为被封闭过程中牛奶的蛋白质说填满，因此结合量很少，后面漂洗时可去除。比较重要的是一抗孵育温度和时间，最常用的条件是4℃摇床过夜孵育，温度适宜，分子运动温和。有人也用37℃孵育1-2h，可能会成功，但是温度越高，分子间的运动越激烈，那么出现非特异性杂带的可能性就越高；同时孵育时间较短，也可能会导致一抗与目标蛋白结合不充分。当然，如果你使用的是多克隆抗体，那情况就更难说了，参考上上期避雷手册。一抗结合之后，就是采用的二抗，二抗可与一抗结合，而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记，可与发光底物相结合，该底物极强的信号输出能够使皮克量的蛋白得到检测。
总之，选好自己的一抗是很重要的。特异性高的一抗，WB你怎么做都能出；特异性差的抗体，WB发明人都不一定做得出来。建议不要省钱买国产抗体，你懂得。买抗体之前，看看近年发的高分文章，查查他们用的什么哪个公司抗体。如果找不到参考，一定要买经过该抗体公司敲除验证过的抗体。

七、蛋白检测
前几步，我们几乎无法看到膜上有啥变化，条带也看不见在哪，反正就是一直将膜洗洗涮涮。终于到了蛋白检测，这也是WB最后一步，终于可以一睹蛋白条带的真容了。
蛋白检测包括DAB法和ECL发光法。DAB法就是和免疫组化染色类似，出现的条带在肉眼下即可见，呈现棕黄色，条带可保存1-2年，但是现在用的较少。目前较多采用的是ECL化学发光法，ECL工作液包括鲁米诺(是的，就是我们在刑侦节目案发现场看血迹的东西)和过氧化物，二者避光保存，现配现用(1：1配制)，用时滴在膜上就行，目标条带将在黑暗环境下发出荧光，荧光会进一步胶片上曝光，荧光越强则胶片上曝光的条带越黑，最后洗出胶片即可。现在还有凝胶成像仪可以使用，省去了胶片曝光和洗胶片的步骤，方便而高效，再也不用去小黑屋待着发光了。
至于胶片上的黑色条带该怎么分析，这又是另外一个话题了，今后会和大家再聊一聊。

终于敲完了，已秃......



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