免疫荧光技术优点？

风云

免疫荧光技术优点？
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卡卡

免疫荧光染色是实验室常用的技术之一，但在操作过程中，有许多需要注意的细节，任何一个环节的失误都可能导致实验失败。本文将为您介绍免疫荧光染色的注意事项，并附上零失误封片技巧。

一. 抗体选择：选择针对您研究的目标蛋白特异性高、亲和力强的抗体，一抗的浓度需要预实验摸索。一抗浓度过高(本身荧光实验，一抗的浓度就较高)，也是造成自发荧光强的重要原因。

二. 抗体稀释：根据抗体说明书建议，使用合适的稀释液和稀释比例进行抗体稀释。

三. Blocking：使用合适的Blocking 液进行Blocking 处理，以减少非特异性结合，一般采用动物血清，在室温下封闭1h左右。建议适当延长封闭的时间至2h。如果室温较低，可以考虑采用37℃孵育箱进行封闭，优化封闭时间，充分去除组织中的类属抗原。

四. 二抗选择：选择与一抗种属匹配的荧光标记二抗，二抗在4℃长时间放置后可能有部分荧光素沉淀，导致染色结果有星星点点的杂质，损失珍贵样本！建议配成工作液后，高速离心，取上清使用。

五. 洗涤：在每一步操作后，充分洗涤以去除未结合的抗体和染料。

六. 封片：选择合适的封片剂进行封片，避免荧光淬灭。

七. 对照设置：设置合适的阳性和阴性对照，以确保实验结果的可靠性。

零失误封片技巧：
一，在滴加封片剂之前，确保切片上没有多余的液体。封片剂也不宜添加过多，可用10ul枪头吸取少量，点在每个样品边缘，缓慢盖片。

二，滴加适量的封片剂，避免产生气泡。
用10ul枪头滴加~5ul/样品（根据组化笔大小 酌情更改封片剂滴加量） 千万不可打出气泡！不要把枪头最后一滴封片剂打出！气泡会严重影响封片效果！
如果不小心产生气泡 → 可以用镊子轻轻将气泡挤出。

三，使用干净的盖玻片，轻轻按压，使封片剂均匀覆盖切片。

四，避免在盖玻片上留下指纹或污渍。
免疫荧光染色的注意事项及零失误封片技巧。希望 这些技巧能帮助您顺利完成实验！！！

清风寡欲

1、细胞膜上的免疫荧光检测法
间接标记法
1)    制备单细胞悬液；
2)    细胞计数，取出 1× 106 个细胞于试管中；
3) 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90 ～ 95%；
4) 在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育 30 ～ 60 分钟；
5)    PBS 洗涤 1 ～ 2 次， 1500rpm，离心 3 分钟，弃上清；



荧光染料

6) 加入二抗，孵育 20 ～ 30 分钟；
7) PBS 洗一次， 1500rpm，离心 3 分钟，弃上清;
8) 加 300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测， 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定，可放置 1 周)。



核酸染料

直接标记法
① ~ ③同间接标记法
④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育 30 分钟；
⑤用 PBS 洗 2 次， 1500rpm，离心 3 分钟，弃上清;
⑥加 300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。



biotium

2、 细胞膜内的免疫荧光标记法
间接免疫荧光标记法
1) 取已制备好的单细胞悬液，用 1 ～ 3%的多聚甲醛固定 30 分钟（也可 4℃ 保存过夜 ）；
2)    用 PBS 洗两次，弃上清；
3)    细胞膜打孔，加入 0.1%皂素 200μl，室温 10 分钟；
4)    用 PBS 洗涤两次；
5) 加入第一抗体， 室温 30 ～ 60 分钟，或 4℃过夜， 同时须设阴性对照或同 型对照管；
6)    用 PBS 洗涤两次；
7) 加入二抗（荧光标记的抗体）室温 20 分钟，避光；
8)    用 PBS 洗涤 1 ～ 2 次，弃上清；
9)    重悬细胞于 500μlPBS 中，上机检测。
直接荧光标记法



荧光素酶

① ~ ⑤同间接荧光标记法；
加入荧光素标记好的抗体，避光 30 分钟（同时做同型对照管）；
用 PBS 洗涤1~2次，弃上清；
加 300μl PBS 上机检测。
细胞膜上及细胞内双标记法（ 直标法）
1) 取出已制备好的未固定的单细胞悬液 1× 10 6 个细胞于试管中； 2)    用 PBS 洗涤两次；
3) 加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原， 同时加上阴性对照管， 室温孵育 20 分钟；
4)   在试管中加入 1％～3％多聚甲醛 1ml，固定 30 分钟；
5) PBS 洗涤两次 1500rpm 3 分钟，弃上清;
6) 打孔，加入 0.1％皂素 200μl 室温 10 分钟;
7) 用 PBS 洗涤两次，弃上清;
8)   加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素
的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温 20 分钟孵育;
9)    用 PBS 洗一遍弃上清；
10) 用 300μlPBS 重悬细胞，上机检测
五、流式细胞术中的几点注意事项：
1 、对照组的设置：
在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值
时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。



流式细胞术

（ 1 ）阴性对照的设置
在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在 实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照管，作为阴性对照。
  在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为 阴性对照管， 实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时 ，同样也可同时设置“ 阴性细胞” 的阴性对照管作为阴性对照。
在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。
（2）、阳性对照的设置：
在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对照设置相同。
2、几点建议：
1) 在实验过程中， 在保证实验的科学性和准确性的基础上， 应尽量减少实验工 序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长， 如再加之操作的不熟练 ， 细胞更容易丢失和受损， 而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围 内， 建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法， 以保证实验的真实性和准 确性。
2)    建议送检细胞一定要足够量， 一般要求 1× 106 个细胞。不要过少。因为，如 细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数， 结果也不可信。 细 胞量也不宜过多， 因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足， 结果也由此受影响。
3) 同一种细胞需同时做双标记时， 须做双标记的同型对照， 且两种抗体所标记 的荧光颜色务必不同。
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长长的路

听说极光是狐狸奔跑后留下的颜色，那这个荧光一定是我通宵达旦实验、披星戴月润色的有所得！！！！
妈妈，我勤勤恳恳工作，呕心沥血整理的实验干货终于有用武之地了！！
~~~~~~我是一条分割线~~~~~~
到底是怎么别具一格的IF protocol让小编流下了喜极而泣的泪水，快来跟小编一睹为快吧！！


IF介绍

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量，通常被用来作为目的蛋白定位的方法。
常见的荧光素
1.异硫氰酸荧光素（FITC）：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
2.四乙基罗丹明（RB200）：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。
3.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。
4.藻红蛋白（PE）：吸收光490~560nm，发射光 575nm，红色荧光。
5.别藻蓝蛋白（APC）：发射光 660nm，其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC是经典的3色搭配组合。
<hr/>IF原理

IF包括直接法和间接法。
直接法是目的蛋白和带有荧光基团的一抗结合；
间接法是目的蛋白和一抗结合，然后一抗再与带有荧光基团的二抗结合，通过荧光显微镜可观测到荧光，进而观测到目的蛋白。



图1 IF实验原理示意图

                                                                表1 IF直接法与间接法对比


<hr/>IF流程

爱美之心人皆有之，化妆之后美美出街吧~~打造高颜值IF，让你的实验和本人一样光彩照人~
1. 细胞样品制备（各类化妆品）

装备齐全开启化妆之旅吧~

①贴壁细胞
将细胞铺在放置有细胞爬片的培养板中，待细胞密度60-70%后使用PBS洗去培养基即可进行细胞固定操作；



图2 贴壁细胞

②悬浮细胞
离心(1000rpm，5min)收集培养皿中的悬浮细胞于EP管中，用PBS洗涤2次即可进行细胞固定操作；



图3 悬浮细胞

③石蜡切片
免疫荧光中的石蜡切片要先进行脱蜡和抗原修复处理（易保存，形态佳）。
④冰冻切片
切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作（抗原保存更佳）。
注意事项
①使用状态良好的细胞进行实验，否则易产生非特异性荧光染色。
②悬浮细胞也可先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴载玻片。

2. 细胞的固定（妆前护肤）

皮肤状态好才方便更好的上底妆和彩妆~

固定的目的
固化样品使细胞内蛋白结构不易发生变化，终止内源性和外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，避免抗原失活或弥散。
常用的固定液
▶ 醛类：4%多聚甲醛，戊二醛固定液（2.5%，电镜专用）影响蛋白构型而固定；
▶ 醇类：如甲醇，乙醇等，使细胞内蛋白和糖类发生沉淀而固定；
▶ 酮类：丙酮。
                                                                    表2 常用固定剂的对比


步骤
甲醛固定
1.吸去培养液，PBS 清洗 2 次；
2.加入4% 甲醛，室温固定 20-25 分钟；
3.PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
甲醇固定
1.吸去培养液，PBS 清洗 2 次；
2.加入冰冷的 100% 甲醇，冰上或 4°C 固定 15 分钟；
3.PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
注意事项
①若固定后不能及时做实验，可将细胞保存于含有叠氮钠或Proclin 300等防腐剂的PBS中 ，4℃一般可保存一个月。
②应根据抗原性质和抗体特性选择合适的固定剂。通常，检测细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果；检测细胞膜相关组分、细胞器和细胞核内抗原一般用多聚甲醛固定。当一种固定方式效果不好时，可更换另一种方式进行尝试。

3.透化（底妆）

服帖的底妆谁不爱？透化让你的底妆扒在脸上

目的
细胞膜打孔处理，使抗体能进入到细胞中和抗原发生结合。
常用的透化液
非离子型去污剂Triton X-100、NP-40 、Tween-20等；Triton X-100、NP-40 可部分溶解细胞膜，更适合核抗原检测；Triton X-100浓度过高或作用时间过长将破坏蛋白，影响实验结果；Tween-20较温和，可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜，更适合膜、浆抗原检测。
步骤
1. 用含 0.1-0.2%Triton X-100 或 NP-40 通透细胞 10 分钟，或用 Tween-20通透 10-30 分钟；
2. PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，吸水纸吸干 PBS。
注意事项
①检测胞内抗原表位需要通透，抗原表位处于胞内的膜蛋白也需要进行通透。
②丙酮、甲醇等本身具有通透作用，因此使用这些固定剂时不需要通透。
③通透一般在固定后进行，但如果目的抗原不溶于水，可先通透再固定。通透可去除大量水溶性蛋白，从而减少背景和非特异性信号。

4.封闭（遮瑕）

把斑驳瑕疵都封闭掉就会更加美貌~

目的
阻断抗体抗原之间的非特异结合，降低背景信号和潜在假阳性信号。
常用的封闭液
1%牛血清白蛋白、10%山羊血清，封闭时间一般为30-60min；对于甲醛固定的样品，加入0.3M 甘氨酸可淬灭醛基引起的自发荧光，得到的结果信噪比更高。
步骤
载玻片上滴加配置好的封闭剂，室温封闭 30-60min。
注意事项
保持样品湿润，避免干燥，否则极易产生较高的背景。

5.抗体孵育（彩妆）

点对点描笔，凸显特异性的美丽~

一抗孵育
直标法的一抗孵育需注意避光，一般室温孵育45min；
间标抗体的孵育和Tubulin一抗共染（注意一抗种属不能相同），过夜孵育的效果更好。
步骤
1. 根据一抗说明书，按照适当比例稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液；
2. 每张载玻片上滴加一抗并放入湿盒，室温孵育 1 小时或 4°C 孵育过夜；
3. 若一抗为 4℃过夜孵育，孵育结束后室温放置 30 分钟左右，进行复温处理，加强抗原抗体的特异性结合；
4. PBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟 ;
5. PBS 洗涤 1 次。
那什么？我也不知道都有哪些直标抗体，哪些是间标抗体呀？这要怎么选啊？
周秘书，安排上，5分钟内我要公司里全部的信息。
                                                              表3 PTMab精选直标抗体产品


二抗孵育

间接法需孵育荧光二抗，一般湿盒室温孵育30-60 min（避光操作），需注意的是二抗种属要和复染的一抗种属相对应，荧光基团一般选择FITC或TRITC。
注意事项
①直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此这些抗体孵育时需避光。
②每次试验均需设置以下三种对照：
a. 阳性对照：确认含有待测抗原的细胞或组织。阳性对照的实验结果应为阳性，可证明待所用试剂及流程方法均可靠。
b. 阴性对照：确认不含待测抗原的细胞或组织。阴性对照的实验结果应为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。
c. 内源性组织背景对照：某些细胞或组织，如脂褐质，因其生物学性质会产生背景荧光，影响结果判读。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。
③间接免疫荧光法中的二抗使用前高速离心，避免二抗中的沉淀在视野中产生明亮的荧光亮点。

6.核复染（修容）

目的
为了显示细胞核所在的位置，需要对细胞核进行染色，DAPI 是常用的核染料。
步骤
1. 在玻片上滴加 DAPI，避光孵育 5 分钟；
2. PBST 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
注意事项
①荧光染色后的细胞片建议先立即观察一下，因为有时封片不当会导致封片后信号消失。
②可选用含有 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，孵育 5 分钟后直接封片。

7.封片及镜检（定妆）

定妆后的完美妆面就完成啦~

封片
滴加含抗荧光淬灭剂的DAPI直接封片，注意避免气泡的产生。
镜检
常用工具有普通荧光显微镜、共聚焦显微镜，荧光染色后一般在1小时内完成观察，或可以4℃保存4小时，时间过长可能会使荧光提前衰减；若不能及时镜检，样品放于-20℃，存放时间不能超过3天。




图4 封片示意图

<hr/>IF应用范围

主要用于研究蛋白的亚细胞定位、蛋白与蛋白的相互作用、细胞信号转导，还用于病原体检测、自身抗体检测、免疫病理检测等等，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。
PTMab高颜值秀场

在确认蛋白的信息之后，它的定位也应该尽在掌握之中啦~以下是景杰抗体的T台秀场，全都经过严格的质控把关，更有免费试用装活动，无套路无隐藏，报名即可参与~



图5 亚细胞结构




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卡卡

组织病理染色是我们做生命科学研究经常需要用到的实验技术，也是基本的实验室技术之一。很多人都认为病理染色相对Western blot（见本人另一文章 Western blot实验技巧之蛋白样品制备、SDS-PAGE胶制备、跑电泳、转膜、孵育抗体、显影和ImageJ分析（来自一位可高频次重复WB结果的科研狗之四年经验总结））来说更容易出结果，这一点我不否认，但要想做出一张漂亮的图（高信噪比）还是有难度的，尤其是免疫荧光。本人在这方面积攒一些经验，做出来的图片受到导师和同学们的一致认可。今天我就跟大家分享一下我艰辛摸索出来的经验，希望能给需要的人一些帮助。



本人在丁香园的个人主页

  我将从取材部分开始讲，到显微镜拍片结束。由于本人主要研究中枢神经系统疾病，所以下面以鼠脑为例。
一、 取材
1、物品试剂准备：生理盐水或PBS（每只小鼠50ml），4%多聚甲醛或者10%中性福尔马林（每只小鼠50ml），麻药，250ml玻璃烧杯两个，泡沫箱两个，泡沫箱盖子一个，1ml注射器一个，20ml注射器两个，7号头皮针一个，大头针四个，止血弯钳（12.5cm）两把，组织剪一把（25cm），眼科剪一把，眼科弯镊一把，10mlEP管若干（一个鼠脑一管，提前装好固定液）。
需要注意的是，如果要自己配4%（质量体积分数）多聚甲醛固定液，则需要购买多聚甲醛固体。配置方法有些注意事项，以配2 L 工作液为例。方法一是加热溶解法，称取80 g 多聚甲醛固体，加入1900 ml PBS工作液中，推荐使用2L 的锥形烧瓶做容器，然后瓶口套上橡胶手套，以减少多聚甲醛挥发，将烧瓶置于烤箱中65 ℃ 烤10 h 左右，可见大部分固体已经溶解，然后转移至磁搅拌器上搅拌15 min，可见溶液几乎完全澄清。溶解后自然冷却，取下手套，加PBS工作液定容至2000 ml，转移至密闭容器中保存，使用前预冷。方法二是加碱溶解法，加0.1 g氢氧化钠固体，无需加热，室温搅拌至固体完全溶解，定容后滴加盐酸将pH调至7.5左右，其他操作类似方法一。
2、取材步骤
心脏灌注  首先是麻醉小鼠。等待麻醉诱导时把两个烧杯分别装上生理盐水和多聚甲，然后将烧杯半埋在冰中预冷。麻醉后用大头针将小鼠固定于泡沫箱盖子上（用组织剪戳个洞，用以引流灌注出来的废液至泡沫箱中），暴露小鼠胸腔和心脏（用止血钳固定，用组织剪剪皮和开胸），注意别剪破肝脏和肺脏了，暴露后持止血弯钳稍微用力夹住一点心尖部（不要锁死钳子,留出进针的缝隙），微微用力向上提，仔细看心尖两侧颜色深浅，较浅那边是左心室部分，然后用头皮针（剪断针尖斜面，以防戳穿心底，提前接上装满生理盐水的注射器并赶走导管中的气泡）从心尖沿着左心室的长轴进针，全神贯注体会手感，当刚好有突破感时再进一点点，这时锁死止血钳。然后用眼科镊夹起右心耳，并以眼科剪剪破之，见暗红的血涌出，接着手推注射器活塞，大概半分钟推完20ml生理盐水，连推4管，这期间观察肝脏颜色、肺脏大小及口鼻有无渗液。灌注成功的判断有以下几点：肝脏在推完40ml生理盐水前逐渐变成桃黄色，肺脏无明显肿大，口鼻无明显渗液。最重要的是看肝脏颜色变化，有时肺脏肿大，口鼻有明显渗液也不一定提示失败。然后是推多聚甲，50ml，注意观察小鼠的四肢及尾巴有无颤动痉挛，一般灌注得好的话会有明显的上述反应，这是多聚甲刺激神经肌肉的结果。灌完多聚甲后，小鼠身体应该硬成板状。（灌注这一步很关键，直接关系到染色效果，尤其是做免疫荧光，红细胞有自发荧光效应，在488和555激发光下都可以看到明亮的荧光，也是很难的一个环节，希望大家重视。）
取脑 用组织剪从耳后剪下头颅，再在头顶正中剪一刀头皮，把其往两侧剥，这时可以透过菲薄的颅骨看到白色的大脑，修剪枕骨大孔附近的颈部肌肉，改用眼科剪，在枕骨大孔3点和9点钟的位置各剪一刀，然后一手固定头颅，另一手用止血弯钳从枕骨大孔处开始依次撬开枕骨，顶骨，额骨，注意钳子尖端不要向着脑组织，以免损坏皮层，还有留意硬脑膜可能扯裂脑组织，暴露至嗅球时用眼科弯镊从嗅球前下方勾起整个脑组织，离断颅底的脑神经，将脑组织转移至装有多聚甲的EP管中。（这一步各取所需，不是研究脑的可以忽略。）
需要灌注取材的视频可以通过微信获取，由于比较血腥，不宜直接放到文章里。
二、 后固定
  取材后将泡在多聚甲的标本置于4度冰箱中，24小时后赶紧进入下一环节：脱水、透明、浸蜡、包埋。这里也要注意，由于取材时进行了多聚甲灌注，所以后固定尽量不要超过24小时，至多一周，固定时间越长，抗原表位被封闭得越牢，后期染色阳性信号越低，尤其是免疫荧光受其影响很大。
三、 石蜡切片之脱水、透明、浸蜡、包埋
脱水：先从多聚甲中取出标本，自来水冲一遍，将脑置于脑模具中切块，一般建议每块厚度在2-3毫米（这里也要提醒一下，不要切太厚，否则脱水浸蜡不充分后期染色容易图片碎片），然后装进包埋盒中，用铅笔标记包埋盒，盖好盖子，置于流水中冲洗2小时，然后转移至浓度梯度酒精中，依次是50% 90min；75% 90min；85% 120min 95% 120min；100%I 90min；100%II 60min。（这里浓度梯度和时间可以根据自己经验加以调整。）
透明：一次是无水乙醇二甲苯（1：1）60min；二甲苯I 30min；二甲苯II 30min；二甲苯III 30min。
浸蜡：（65度）石蜡I 60min；石蜡II 60min；石蜡III 30min；石蜡IV 30min。
以上三步一般在自动脱水机中完成。
包埋：选择合适大小的蜡托进行包埋，底面积最好要是标本截面面积的5倍以上，注意不要有气泡。包埋后蜡块常温保存即可，一般存三五年都影响不大，有人说可以存几十年。
四、冰冻切片之脱水、包埋
脱水：冰冻切片的样本用梯度蔗糖溶液（PBS为溶剂）脱水，组织先浸泡于15%蔗糖溶液(质量体积分数)静置过夜，待组织沉底后换30%蔗糖溶液，再次过夜沉底后可进行OCT包埋。
包埋：建议在冰冻切片机的冷台包埋，这样一是可以避免液氮速冻容易造成组织碎裂，二是可以避免-80℃慢冻形成冰晶。OCT包埋后用锡纸包裹组织，提前在锡纸外表面做好标记，然后转移至-80℃冰箱中保存。
五、 切片
石蜡切片一般选择4-6微米的厚度，有3个注意事项，一是切之前先预冷，可以开启包埋机的冷台，零下4度，提前20min冻，然后切的过程中蜡块升温变软容易皱，这是可以再放回冷台冻一阵再切。二是刀片要用新的，如果看到切出来的切片有明显划痕赶紧换个新的位置切。如果没有冷台就放-20度冰箱预冷，切的过程也可放在冰上复冷。三是保存条件，如果一月之内做染色的常温保存即可，如果考虑要存放超过一个月的，可以放4度冰箱，还可以装在抽真空袋中再放冰箱。建议要染色时再切，因为片子切了之后就暴露在空气中了，会氧化，后果是信号减弱，背景加深，尤其是做免疫荧光。



左：石蜡切片放置了一年再染色； 右：石蜡切片放置了一周就染色。说明：左图中片状的绿色荧光为非特异性信号，右图的信噪比远高于左图。

冰冻切片一般选择20-40微米的厚度。冰冻切片有两种常规方法，一是漂片，漂片是组织切片直接浸泡于防冻液中保存，染完色才贴片拍照；二是贴片，贴片是切片先贴于载玻片上（注意防皱），-80℃保存，染色操作在载玻片上完成。
六、 石蜡切片之染色（从烤片到封片）
烤片：将片子放置于染色架上（一般用不锈钢的，做跟铁染色相关的可以用塑料的），65度烤1-2小时。
脱蜡：迅速从烤箱中转移至二甲苯中，二甲苯I 10min；二甲苯II 10min；二甲苯III 10min。
水化：高浓度到低浓度酒精，100% 5min；95% 5min；85% 5min 75% 5min。（冰冻切片无需烤片脱蜡水化）
  从这一步开始HE，组化和免疫荧光染色就各不相同了。
1、 HE：苏木素伊红染色（冰冻切片不推荐用于HE染色）
  水化后流水冲洗5min，苏木素染色10min，流水冲洗10min，1%盐酸酒精分化2s，流水冲1min，伊红染色30s。
脱水：75%酒精30s，85%酒精1min，95%酒精5min，100%酒精5min。
透明：二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，二甲苯III 10min。
封片：中性树胶封片，用棉签棒蘸，这里有两个小技巧，一要在二甲苯未完全挥发之前加树胶，借助二甲苯的溶解增加树胶的流动性，这样能减少气泡；二要控制树胶的量，每张切片一小滴就够了。封完片留在通风橱中1小时后再取出，因为二甲苯没挥发完，直接拿出通风橱会污染室内空气。
2、 组化染色（SP三步法DAB显色）
漂洗：水化后纯水摇洗，3min X 3次；
抗原修复：微波炉，柠檬酸钠抗原修复液（pH6.8），先预热，然后将片子置入修复液中，高火煮至沸腾，转中火维持10min；接着自然冷却至室温（注意不要将片子从修复液中提起，不能让组织切片骤冷）；注意了，此步之后透明封片之前不能干片，否则会有明显的边缘效应，就是干过的地方有稍微深染的黄色背景。
PBS摇洗，3min X 3次；组化笔圈起组织；（冰冻切片较厚，这里建议用0.3% Triton X-100（溶剂为PBS）透化膜15min，然后PBS摇洗）
封闭内源性过氧化物酶活性：常温孵育3%过氧化氢溶液15min；
PBS摇洗，3min X 3次；
血清封闭：10%二抗同源血清（PBS稀释）常温封闭30min；
孵一抗：滴加一抗（10%二抗同源血清稀释），注意覆盖全组织即可，湿盒（放少量水）中4度孵育12-18小时；
复温30min：从冰箱将湿盒拿出室温环境中静置30min。
PBS摇洗，5min X 3次；
孵二抗：滴加生物素标记的二抗（10%二抗同源血清稀释），常温孵育15min。
PBS摇洗，5min X 3次；
孵HRP：滴辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（PBS稀释），常温孵育15min。
PBS摇洗，5min X 3次；
DAB显色：DAB工作液现配现用，每张切片覆盖全即可，镜下观察，秒表计时反应时间，同一个指标尽量控制相同的反应时间。注意不要20倍及以上的高倍镜观察，否则显色液会污染镜头。
显色结束用自来水终止反应，流水冲洗5min；
苏木素染色3min，流水冲洗10min；
1%盐酸酒精分化2s，流水冲1min；
脱水、透明、封片操作同HE染色相应部分。
3、 免疫荧光染色
水化后纯水摇洗，3min X 3次；
石蜡切片之抗原修复：微波炉，EDTA抗原修复液（pH8.0）或者Tis-EDTA抗原修复液（pH9.0），这里的修复液跟组化用的不一样，因为组化的是三步法，多了一级放大，所以组化的灵敏度高许多，但是荧光只有两步，灵敏度低，所以要从抗原修复的途径增大最后的信号，一般来说pH越高，不要超过9.5，抗原表位修复得越充分，但也要注意脱片的问题。举个例子，我之前有的指标，用其他修复液加长修复时间和升高修复温度都比不上Tis-EDTA抗原修复液的效果，操作同组化相应步骤。
TBS摇洗，3min X 3次；组化笔圈起组织；
封闭：10%二抗同源血清常温封闭60min；
孵一抗复温同组化相应部分；
TBST（TBS中加0.1%吐温20）摇洗第一遍5min ，然后TBS摇洗3min X 2次；
孵二抗：荧光二抗之后的步骤开始避光操作，滴加二抗（10%二抗同源血清稀释），常温孵育60min。
TBST摇洗第一遍5min ，然后TBS摇洗3min X 2次；
孵Dapi：滴加Dapi水溶液，常温孵育10min；
TBST摇洗第一遍5min ，然后TBS摇洗3min X 2次；
封片：抗荧光淬灭剂封片剂，用棉签棒蘸取少量封片剂，这里分享一个消除气泡的技巧，一手倾斜载玻片，使封片剂液滴倾斜，另一手将盖玻片倾斜式缓慢盖上，仔细观察，待盖玻片接触到封片剂后才松手，否则气泡将几乎不可避免，本方法是我摸索了很久才发现的，在我发现之前，整个中心实验室还没有人找到很好地消除气泡的办法。然后指甲油加固，涂在盖玻片两侧。以下是视频演示：


七、冰冻切片之染色（无需烤片和脱蜡）
1、组化染色（SP三步法DAB显色）
漂洗：从-80 ℃ 取出片子晾干，PBS摇洗，3min X 3次。
后续操作从抗原修复到封片，操作基本与石蜡切片的相应步骤一致，唯一的不同是在抗原修复后增加透膜这一步（见冰冻切片免疫荧光染色部分）。
2、免疫荧光染色
漂洗：从-80 ℃ 取出片子晾干，PBS摇洗，3min X 3次。
抗原修复：由于冰冻切片在EDTA抗原修复液中热修复极容易脱片，所以推荐使用柠檬酸-EDTA混合抗原修复液（具体配方私聊）。这样既能充分修复抗原又能保证不脱片。修复冷却后，TBS摇洗，3min X 3次；组化笔圈起组织；
透膜：0.3%PBST（Triton X-100）常温孵育15min；
  TBS摇洗，3min X 3次；
后续操作从血清封闭到封片同石蜡切片免疫荧光染色相应步骤。
八、 拍照
拍照前准备：拍照前先检查片子上有多余的树胶，封片剂，灰尘等影响观察或污染镜头的因素，如果树胶干了很难清洁怎么办，可以用无水乙醇棉球擦拭，注意不要来回擦，要同一个方向擦，棉球擦过接触面就不能再擦了，因为接触面溶解了树胶，回擦又弄脏了擦过的地方，清洁干净后方可镜下拍照。
明场拍照：注意先拍低倍再拍高倍，命名要对应，匹配好光圈，可以选自动曝光，自动白平衡，一般同一批片子尽量用相同的参数拍。
荧光拍照：避光拍照，除了明场拍照的要求外，更要注意的是在激发光的照射下荧光信号回很快衰减，所以要干脆利落。这里要强调的是同一个指标拍照参数要基本一致，包括激发光光强，曝光时间，增益大小，亮度对比度。还有两个困扰很多实验者问题，一是Dapi与FITC通道串色(在FITC通道可以看到本来在Dapi出现的形态)，这是因为这两者的激发光波长相邻，发射光波长相近，在Dapi通道下强曝光之后就会发生明显的串色，我发现有一个办法能很好地解决这个问题：就是用很低光强去激发Dapi（5%以下功率），大幅调小Dapi曝光时间，10倍镜用50ms左右，20倍镜用5ms左右，40倍镜用30ms左右，然后先拍其他通道的最后拍Dapi，这样基本就不串色了。最后核拍出来可能不太清晰，拍完后处理，增加亮度，因为核不需要特别好看，能说明目的蛋白的定位即可。二是Txred（555nm）与Cy5(647nm)容易串色，原理跟上述问题相同，但是因为这两者都是目的，不好调，所以一般不建议染三个靶标，实在要染，可以试一下不染核，用Dapi通道波段的荧光二抗，488,555或者647来三标。
以上是今天的全部内容，祝各位实验顺利，早出成果，更多细节问题，可以在讨论区留言。如果觉得有用，欢迎点赞、收藏和转发推荐给你身边的人。若需紧急咨询答疑，获取EDTA抗原修复液配方或灌注取材的操作视频，请联系微信( _17665739136,注意有下划线), 付费答疑，先发图片和问题，然后语音电话或者腾讯会议讨论，每30分钟50元（语音通话时间）。
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免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。


一、实验步骤



1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）

（1）对于贴壁细胞：
先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。
（2）对于悬浮细胞：有2种方法，
①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。
（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。
2、 固定（防止离体组织自溶抗原扩散）
固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。
以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。
3、通透（目的是使抗体进入胞内）
0.5%Triton X-100( 一种去垢剂，用PBS配制 )室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。
4、封闭（减少一抗和二抗与非特异位点进行结合）
通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。
5、一抗孵育
根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST， 在摇床上缓慢摇动洗涤5min，共洗涤3次
6、荧光二抗孵育
用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。   
7、复染核（定位的关键）
在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI；
8、封片及荧光观察：用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。
二、常见问题
1、弱荧光信号

可能问题	解决方法
错误的激发波长	确保激发波长与荧光基团激发光波长相匹配
不兼容的一抗或二抗	注意种属问题
固定过度或不充分	适当调整时间
样本保存不当	注意避光
一抗不好用	建议做阳性对照确认抗体的有效性

2、高背景

可能问题	解决方法
洗涤不足	充分洗涤，适当增加洗涤次数
样本干燥	在湿盒中孵育抗体，避免样本干燥
封闭不充分	延长时间或更换封闭液
抗体浓度过高	预实验滴定，确认最佳浓度
二抗非特异性结合	不加一抗，只加二抗，作对照
样本自发荧光	提前检测样本自发荧光情况

3、细胞/组织形态被破坏

可能问题	解决方法
组织切片从玻片上脱落或切片有气泡	适当增加固定时间
组织切片撕裂或有褶皱	切割刀片不太锋利，考虑重新切片
细胞或组织固定不充分，自发裂解	适当增加固定时间，使用交联性固定剂

三、注意事项：对照实验的设置

1、 内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。


2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。
3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。
IF 常见问题及优化方案


本文转自小张聊科研及相关网络内容整理