前沿 | 分子检测技术继续下沉，莱斯大学开发出等温扩增+侧向层析技术的HPV POCT测试

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莱斯大学的一个研究小组开发了一种结合了等温扩增和侧向层析技术的人乳头瘤病毒（HPV）即时检验测试。
该团队在本周发表在《Science Translational Medicine》上的一篇论文[1]中描述了该检测方法的开发和验证情况。莱斯大学生物工程系前博士后研究员、该论文作者之一Kathryn Kundrod说，该测试使用重组聚合酶扩增法来扩增两种HPV基因型的DNA存在，结合侧向层析技术来产生一个直观的阳性或阴性结果。


运行该测试需要用裂解酶处理拭子样本，该样本可以由医生或病人收集，然后在裂解后离心样本以限制细胞碎片的干扰。然后，DNA被稀释并加入到含有RPA试剂混合物的室中，在那里进行扩增。之后，将试管放入侧向流动试剂盒，15分钟后就能得到结果。如果包括离心和样品制备步骤，整个过程大约需要45分钟。
扩增管和侧流试剂盒的整合还避免了潜在的环境交叉污染，这种污染可能影响检验的准确性并导致假阳性结果。
当测定开发完成之后，研究人员就在高资源环境（休斯顿的一个实验室）和低资源环境（莫桑比克的一个医院实验室）中进行了验证。在休斯顿的验证研究中，对于每个反应至少有1000个HPV 16 DNA拷贝的样本，灵敏度为100%，阳性预测值为86%，而阴性预测值为56%。对于每个反应至少有500个HPV 16 DNA拷贝的样本，该测试的灵敏度为93%。由于该组中很少有HPV 18样本，该小组只确定了该测试的特异性，即100%。钙测定和罗氏的Cobas HPV检验之间的总体一致性为85%。
在休斯顿的验证研究中，被Rice检验遗漏的不一致样本的拷贝数都很低，该团队“并不特别担心遗漏”，因为高拷贝数的样本是最重要的。
莫桑比克验证研究的结果略有不同，一些不一致的样本除了拷贝数低之外，还具有高细胞含量。其中部分原因是在于该队列中所有的样本都是自行采集的。临床医生采集的样本和自我采集的样本之间的差异表明，需要在测试中加入一个细胞对照，以捕捉任何因细胞含量高而导致的假阴性，目前，该团队正在积极开展这项工作。
在该队列中，该测试对周期阈值（Ct）小于30的HPV 16样本显示出80%的灵敏度，表明DNA拷贝数很高。在Ct值小于35的HPV 16样本中，包括稍低的DNA浓度，该检验的灵敏度为83%，特异性为89%，阳性预测值为73%，而阴性预测值为85%。在HPV 18样本中，特异性为98%，阴性预测值为85%。
Kundrod表示，这种检验的一个主要用途是在低资源环境中进行HPV筛查和治疗计划。尽管即使在这些环境中，离心机也是比较常见的设备，但研究人员正在开发无需仪器的样本制备方法，以完全消除离心的需要，并进一步削减成本。
除了新的样本制备方法和细胞控制之外，使该检验在临床上发挥作用的另一个主要步骤是在HPV 16和HPV 18之外增加其他HPV基因型。这项测试中包括的两种基因型约占宫颈癌病例的70%，但该团队希望再增加三到五种基因型，以使该测定更加强大。为了做到这一点，该团队一直在研究一种方法，将扩增管分离成多个腔室，这些腔室将包含不同基因型的试剂。
增加更多基因型的关键复杂性之一是确保每种基因型的扩增试剂不会相互干扰，因此物理上分离试剂将缓解这一问题。Kundrod说：“这将是一项真正类似的整体技术，只是在同一个测试中发生了几个额外的、可比较的平行反应。”
研究人员希望在更大、更多样化的临床试验中验证该测试，以确保该测试在不同人群和多种样本类型中发挥作用。他们还与一家外部公司合作，以优化该平台，并确保在商业化的时候，它可以大规模地生产。
在Kundrod看来，该测试的主要好处是缺乏复杂性，无污染的格式，以及与市面上的测试相比成本较低。除了试剂盒本身之外，Rice测试只需要一个加热块和离心机，这两样东西都比较容易买到，每个大约500美元。而滤芯和试剂的总成本估计约为5美元。
验证研究中使用的对比测试，即罗氏在休斯敦的Cobas HPV测试和Cepheid在莫桑比克的护理点Xpert HPV测试，分别需要一台Cobas仪器和一台GeneXpert仪器。其他许多HPV检验，如Hologic公司的Aptima HPV检验、雅培公司的RealTime高危HPV检验和Becton Dickinson公司的Onclarity HPV检验，都在这些公司自己的平台上运行，尽管这些检验能检测HPV 16和HPV 18以外的其他HPV基因型。凯杰公司还为资源有限的环境提供了CareHPV检验，它使用该公司的Hybrid Capture 2技术来检测14种高危HPV基因型。
Kundrod表示，研究人员的目标是将该检验用于能够在一次预约的时间范围内获得可操作的结果的环境中，比如在社区卫生诊所或医院，这些诊所可以进行检验并根据结果一次性提供治疗。
“我们所设想的实际上是在离人们居住地更近的地方，在他们自己的社区，通过一次预约来实现整个连续的护理，以真正增加获得的机会。”
参考文献

• Kundrod KA, Barra M, Wilkinson A, Smith CA, Natoli ME, Chang MM, Coole JB, Santhanaraj A, Lorenzoni C, Mavume C, Atif H, Montealegre JR, Scheurer ME, Castle PE, Schmeler KM, Richards-Kortum RR. An integrated isothermal nucleic acid amplification test to detect HPV16 and HPV18 DNA in resource-limited settings. Sci Transl Med. 2023 Jun 21;15(701):eabn4768. doi: 10.1126/scitranslmed.abn4768. Epub 2023 Jun 21. PMID: 37343083.
  

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