Western Blot上样技巧总结：实验成败在此一举！

生物科研实验室

为了确保Western Blot（WB）实验结果的有效性和可重复性，其中很重要的一点就是样本如何上样？通常，小伙伴们面临选择是以相同的蛋白量上样还是以相同的体积上样。每种方法都有其优势和局限性，但以等蛋白量上样通常被认为是更为严谨和科学的方法。这是因为蛋白质表达水平的变化对实验结果的解释至关重要，而等蛋白量上样可以较直接地反映这些变化。
等蛋白量上样可以比较不同样本中目标蛋白的相对含量，从而更准确地评估生物学变化或处理效果。此外，这种方法可以减少由于样品制备过程中蛋白质浓度的微小差异而引起的变异性。尽管等蛋白量上样提供了更标准化的结果，但实际操作中需要确保准确的蛋白质定量，这通常通过BCA、Bradford或其他类似蛋白质定量测定法来实现。一旦确定了每个样品的蛋白质浓度，就可以通过调整每个样品的上样体积来确保每个泳道中的蛋白质总量相等。先看下如何提取蛋白？1. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。2. 如果是收集的细胞样本，需去除细胞培养液，用1xPBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白不干扰后续实验，可以不洗）。以六孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用移液器反复吹打，使细胞和裂解液充分接触。如果是组织样本，需做10%组织匀浆，具体流程：称重，每个样本取一定质量的组织，加入9倍体积的RIPA裂解液，做组织匀浆。3 .将含有样品和裂解液的离心管置于冰上放置30min，期间每隔10min vortex一次，使样品裂解充分；4℃10000-14000g离心10min，取上清，备用（如蛋白不能及时使用，可以冻存于-80℃保存；用于IP或Co-IP等特殊实验抽提蛋白时只需将RIPA裂解液换成IP裂解液，其余步骤一样，但抽提好的蛋白上清不能冻存于-80℃，应及时进行后续实验）。4.BCA蛋白定量试剂盒取A液和B液以50:1的比例混匀，96孔板每孔加入200μl，另用标准品做一标准曲线，浓度梯度如下：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0μg/ml；每孔加入标准品或样品25μl，37 ℃烘箱中孵育30 min，用酶标仪在562 nm波长下检测标砖品或样品的吸光值，标准曲线的R2大于0.99为最好结果。计算出相应蛋白浓度（μg/μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg /μL）。
试剂配方：试剂A (1 L):分别称取10g BCA (1%)；20g Na2CO3·H2O (2%)；1.6gNa2C4H4O6·2H2O (0.16%)；4g NaOH (0.4%) ；9.5g NaHCO3(0.95%) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。试剂B (20 mL):取0.8g CuSO4·5H2O(4%)，加蒸馏水至20 mL。标准蛋白质溶液称取0.1g 牛血清蛋白，溶于蒸馏水中并定容至10 mL，制成10mg/mL溶液。
蛋白上样量调节WB蛋白上样量为：每个孔上样约20~50μg，每个孔上样10-35μL，所以蛋白浓度最好不要低于1 μg/uL。将每个样品稀释到与浓度最低的样品的浓度一致，只需要加入 (当前浓度/最低蛋白浓度) -1的蛋白提取液体积
注意：为了最大化蛋白质的稳定性和减少降解，建议以高浓度存储蛋白质。需要注意的是，蛋白质浓度越低，其降解速度越快。因此，如果手中的蛋白质总量很充足，可以选择仅取一部分进行必要的稀释，而将剩余的蛋白质分装并冷冻保存在-80°C的冰箱中。这样处理不仅可以保持蛋白质的稳定性，还能确保未来使用时蛋白质的活性和效能。