【Western-Blotting】干货！WB步骤及经验分享

幸福侠侣

Western-Blotting的标准流程（protocol）如下：
（1）细胞及组织收集：见《【Western-Blotting】WB样品准备》；
（2）细胞/组织裂解及蛋白定量：见《【Western-Blotting】蛋白提取与蛋白定量》；
（3）SDS-PAGE凝胶制备：见《【Western-Blotting】WB相关buffer配制及SDS-PAGE制备》；
tips：笔者经验是在裂解细胞/组织（30min）的同时配制SDS-PAGE的下层胶，待细胞理解完成可离心收集裂解液上清（4℃，10-15min），离心同时可配制SDS-PAGE上层胶，待上层胶凝固过程中可进行蛋白定量。
（4）蛋白电泳：
a、组装SDS-PAGE：将配制好的SDS-PAGE胶组装在Western-Blotting电泳系统中(注意厚玻璃板稍高、靠外放置，薄玻璃板稍矮、靠内放置，水平放置时厚板在下、薄板在上记为正面）；
b、蛋白上样：加入电泳缓冲液，每孔上样量为10-20 μL（蛋白总量10-20ug即可），蛋白marker上样3-5 μL（注意保证上样体积尽量一致，否则可能导致蛋白条带不在同一水平线；上样时可用10 μL移液器缓慢滴加，切忌快速吹打以免引起蛋白样品溢出，此外，上样体积最好不要接近上样孔的总体积，笔者经验10孔板每孔上样体积不宜超过40 μL，15孔板上样体积不宜超过25 μL；当然，上样孔的总体积大于上述数值）；
c、接通电源、开始电泳：80 V电泳50 min，待蛋白marker到达分离胶改用120 V电泳2 h至蛋白marker到达分离胶底部，停止电泳（电泳参数不同实验室习惯不一，也可一段式即无需调整电压；大多数实验室多采用两段式：低电压80V左右缓慢电泳压平样品，稍高电压120V左右快速分离分子量不同的蛋白）；
tips：一般来说电泳液最好现配现用，方便纠错；但是大多数研究者的经验式，电泳液可反复使用，内槽一般选用新鲜电泳液，外槽可选用回收电泳液，外槽电泳液高度一般无特殊要求，有的研究者习惯外槽电泳液高度显著低于内槽电泳液高度，造成所谓“电势差”，笔者经验这种电势差对电泳时间和WB结果无明显影响；此外，有研究者会疑惑电泳液可重复使用多少次，笔者经验是n次，n≥10，均不影响实验结果。
（5）转膜：小心撬开电泳凝胶板，裁取整块分离胶并放入预冷的湿转缓冲液，选取大小适当的NC膜，按“三明治”的形式从上到下依次摆放2层海绵、2张滤纸、分离胶、NC膜（或PVDF膜）、2张滤纸、2层海绵，组装湿转系统，灌满预冷1× 湿转缓冲液，没过“三明治”，室温100 V湿转60 min；
tips：a、湿转液需提前预冷，笔者习惯电泳开始时将湿转液置入制冰器或者-20℃冰箱；b、转模时最好整块分离胶转膜，以免裁胶时丢失部分蛋白；c、做“三明治”的基本原则是“黑胶白膜”，即分离胶贴近湿转夹黑色面、NC膜贴近湿转夹白色面（或红色面）；d、在制备“三明治”时，笔者习惯膜在下方、胶在上方，如此蛋白条带顺序和SDS-PAGE正面时的上样顺序完全一致，方便记忆；e、湿转液最好是现配现用，但也可重复使用，pubmed有团队证实湿转液可重复使用5次，而不明显影响实验结果；f、湿转时，最好在冰箱/冷室（cold room）或者置于冰盒中，在电泳时间小于1h时，笔者习惯预冷湿转液、室温转膜；g、湿转条件亦有选择恒流的，比如200mA，2h等，笔者所使用的湿转条件对分子量为15-140kd的蛋白均适用；h、PVDF膜需用甲醇预激（数秒钟即可），使得PVDF带正电，能更好地与带负电的蛋白结合，而NC膜无需预处理;i、制作“三明治”时注意排除SDS-PAGE胶与NC膜之间的气泡。
（6）封闭蛋白抗原
利用0.1% TBST配制10%脱脂牛奶，将NC膜从湿转系统中取出，并用0.1% TBST润洗2-3次，每次5 min，加入适量脱脂牛奶，室温摇床上封闭60 min（封闭用牛奶、BSA或者封闭液均可回收，4℃保存，反复使用数次）；
（7）抗原抗体反应：基本原理见《【Western-Blotting】WB核心理论：抗原抗体特异性反应》
a. 0.1% TBST润洗封闭后的NC膜3次，每次5 min；
b. 稀释一抗：稀释液通常为脱脂牛奶或0.1% TBST，比例通常为1：1000（稀释比例参见抗体说明书）；
c. 孵育一抗：4 ℃下摇床，过夜封闭；
d. 回收一抗，-20℃保存供重复使用，0.1% TBST润洗NC膜3次，每次5 min；
e. 孵育二抗：0.1% TBST稀释HRP标记的对应种属的二抗，比例为1：5000-1：10000，室温下摇床孵育60 min；
f. 0.1% TBST润洗NC膜3次，每次10 min；
tips：抗体孵育条件、时间等详见《【Western-Blotting】WB核心理论：抗原抗体特异性反应》；
（8）显色
按1：1的比例将ECL发光剂中A液和B液混匀，转有蛋白面的NC膜贴敷ECL发光液，室温下反应2 min，吸干ECL发光液，暗室内曝光、显影、定影及胶片扫描（国内较常用的是化学发光仪，但敏感性不如胶片曝光）。

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