实验技能 | 第一期：常见核酸（DNA）提取和纯化的方法

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本期主要介绍DNA提取和纯化的方法！为什么会选择以DNA提取和纯化的方法作为第一期介绍呢？相信很多小伙伴都知道，核酸作为一切分子生物学研究的基础。核酸提取通常是开启生物学研究的第一步，而且提取的核酸质量高低也是决定下游实验成败的关键因素之一。无论后续的克隆、PCR、QPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。

• 什么是核酸？
  

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(rRNA)，信使RNA（mRNA）和转移RNA（tRNA）。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。


2. 核酸提取类型
2.1 总RNA提取
总RNA中，75-85%为rRNA（主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。
2.2 miRNA提取
MicroRNAs（miRNAs）是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs（siRNAs），通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
2.3 基因组DNA提取
进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
2.4 质粒抽提
质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
3. DNA提取的基本原则
3.1  保证DNA结构的完整性
不同的下游实验对于DNA结构的完整性有所区别。如PCR、Southern杂交这一类实验基本保证所需片段的完整，而二代测序实验为了获得全面的序列信息对DNA的完整性要求更高。
3.2  保证DNA的纯度
去除对下游实验中酶分子有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子，将蛋白质、多糖、多酚等生物大分子的污染降到最低，去除其他核酸（如RNA对后续实验的影响）。
4. 样本类型和特点
4.1 常规医疗样本
样本类型：血液、动物组织、培养细胞、鼠尾等。
特点：细胞数量较多、样本成分相对单一。
4.2 特殊医疗样本
样本类型：血清、血浆、鼻咽拭子、痰液、支气管/肺泡灌洗液、腹水、病毒、粪便、FFPE样本等。
特点：细胞数量少、样本成分复杂。
4.3 植物样本
普通植物样本类型：拟南芥、小麦、玉米、水稻等。
特点：存在细胞壁这样的保护结构、细胞内部还有液泡、叶绿体等细胞器成分相对复杂。
多糖多酚类植物样本类型：水果果肉、植物种子等。
特点：多糖与核酸理化性质一致、多酚氧化后易于核酸结合，影响DNA的提取。
4.4 微生物样本
细菌样本类型：革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌等）、革兰氏阴性菌（大肠杆菌等）。
特点：有细胞壁，有的细菌还有鞭毛和荚膜。
真菌样本类型：酵母、真菌菌丝等。
特点：存在以多糖为主要成分的细胞壁、细胞内部成分相对复杂。


5. DNA提取纯化流程
5.1 样本采集与保存
5.1.1 新鲜：新鲜样本中受到内源性核酸酶影响相对最小，得到DNA质量相对更好。
5.1.2 适量：投入过多样本，后续样本裂解不充分从而影响DNA提取情况，还会引入过多杂质及内源性核酸酶。
5.1.3 不同类型的样本在采集与保存时也会存在差异
5.1.3.1 植物组织保存时间：对于含有多糖多酚等次生代谢产物的衰老叶片可在4℃黑暗环境下饥饿1-2天；进行低温或冷冻保存可以避免内源性DNA酶对样本中的DNA进行一个降解。
5.1.3.2 动物组织保存时间：-20℃短期保存（1-3个月），-70℃长期保存；福尔马林固定时间8-24h内为宜，样本存放时间不宜超过1年；FFPE样本保存温度4℃，建议不超过3年。
注：不同样本因含有内源的酶和DNA的量有所差异，保存时间也有不同。长时间使用福尔马林进行固定，里面有效成分甲醛会引起生物大分子之间形成广泛的亚甲基交联桥使DNA分子脆性增加，在剪切力的作用下，DNA分子容易断裂，同时DNA与蛋白质之间经广泛交联之后，可形成牢固的复合物，这样也阻止蛋白酶对组织的消化，从而影响DNA的提取。
5.1.3.3 血液（全血）：可使用不同抗凝剂的抗凝管进行采集和保存；避免反复冻融，4℃短期保存3-4天，-20℃下可最多保存2年，-70℃下长期保存：全血、白细胞、血凝块、血清或血浆。
5.2 样本处理方式
5.2.1 动物组织：液氮研磨或匀浆。
5.2.2 植物组织：液氮研磨（最推荐），研磨充分又保证样本处于低温条件下避免DNA降解。
5.2.3 哺乳动物血液样本：DNA存在于含有细胞核的白细胞中，而大量存在的红细胞会引入更多杂质和核酸酶，所以需要提前使用红细胞裂解液对红细胞进行去除。
5.2.4 细胞样本：贴壁细胞胰酶消化处理再做收集，悬浮细胞只要离心弃上清。
5.2.5 细菌样本：溶菌酶破壁处理，如金黄色葡萄球菌加入一定量的溶菌酶在37℃条件下孵育30min就可完成破壁的处理。
5.2.6 真菌样本：酶解破壁或液氮冻融或超声裂解法。
5.2.7 FFPE样本：脱蜡处理（二甲苯或矿物油类的物质进行脱蜡处理）。
注：脱蜡不完全，残留的石蜡会阻碍裂解液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶k与组织内蛋白的接触，进而影响组织裂解以及DNA的释放。


6. 样本裂解方法、原理及优缺点比较
6.1 基因组DNA
6.1.1 CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以溶解细胞膜，与核酸结合形成在高盐环境下可溶的复合物。
注：低于15℃会形成沉淀，并且析出，将其加入到冰冷的样本之前必须要预热，并且后续的离心温度一定不要低于15℃。
CTAB裂解液主要组分及作用：

• Tris-Hcl (PH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。
  
• EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。
  
• Nacl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相中。
  
• CTAB裂解细胞，与核酸结合形成在高盐环境下可溶的复合物。
  

6.1.2 SDS法：SDS法（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，高温（55-60℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，在高盐环境下或降低温度后蛋白、多糖等结合形成的复合物沉淀，释放核酸。
6.2 质粒DNA
6.2.1 碱裂解-SDS法：在氢氧化钠（PH12-12.6碱性环境）和去污剂SDS的作用下细胞破裂，细菌蛋白质和染色体DNA变性，双链DNA氢键断裂，DNA变性。加入酸性高盐缓冲液后PH恢复中性，共价闭合环状质粒DNA复性速度快于线性的染色体DNA。细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物被SDS包盖。之后复合物沉淀下来，质粒DNA留在上清中。
6.2.2 煮沸法：含有Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中加热至100℃使细菌裂解。通过加热破坏细菌外壁的同时有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。温度下降后，闭环DNA形成超螺旋分子，离心时留在上清中。


7. 纯化方法、原理及优缺点比较
7.1沉淀法：酚/氯仿抽提去除蛋白质，之后使用乙醇或异丙醇沉淀DNA。7.2 离心柱法：通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附DNA。


7.3 磁珠法：通过磁珠表面修饰（硅基质）从而特异性吸附核酸。


8. 检测与产物保存
8.1 浓度检测
8.1.1 紫外分光光度计进行测量

• 检测原理：核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，最大吸收波长是260nm。
  
• 优点：操作简便、迅速。
  缺点：无法区分DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其他杂质，易得到浓度虚高值。
  
• 常见仪器：Nanodrop、Onedrop。
  

8.1.2 Qubit荧光计进行测量

• 检测原理：采用荧光染料与特异的靶分子结合后发出荧光，仪器接收荧光值转化为浓度数据。
  
• 优点：灵敏度较高，操作简便。
  
• 缺点：成本高，价格较贵；无法直接区分降解核酸。
  

8.2 纯度检测
8.2.1 紫外分光光度计进行测量

• OD260：核酸的吸光度；
  
• OD280：蛋白质的吸光度；
  
• OD260/OD280 =1.7-1.9 说明纯度很好；
  
• OD260/OD280 <1.7 表明可能有蛋白质残留；
  
• OD260/OD280 >1.9 表明DNA可能存在部分降解，建议进行完整度检测或存在RNA残留；
  

8.2.2 琼脂糖凝胶：判断有无RNA、蛋白残留。1%-2%琼脂糖，上样1-3ul。


8.3 完整性检测
8.3.1 琼脂糖凝胶：判断DNA有无降解。1%-2%琼脂糖，上样1-3ul。
通过胶图中DNA条带情况来判断，完整的基因组DNA条带单一且明亮，无任何拖尾或弥散。出现不同程度的降解，胶图中可看到不同程度的拖尾或弥散。降解越严重弥散越亮，片段大小会越小。


8.4 DNA样本保存
保存形式：建议分装保存，避免DNA反复冻融，影响DNA的完整性。
短期保存（保存液）：对下游实验中离子浓度要求比较高的——PH为弱碱性的无菌水。对离子浓度要求不高的--TE缓冲液（Tris、EDTA）。
长期保存：乙醇。
保存温度：-20℃/-80℃下可长期保存，4℃下保存时间最好不超过14天。

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