Western Blot基本原理及步骤

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Western blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
1、 蛋白样品的制备（前一篇文章有，这里不再赘述了）
2、配胶
根据蛋白的分子质量选择百分比不同的胶。
①清洗胶板：用清水冲洗胶板，直至胶板表面没有任何污物。
②验漏：将胶板安装在胶架上，向胶板内注满ddH2O，静置2min,观察是否渗漏。如果渗漏，重新装配胶板胶架。


③风干、冷却：确定胶板不渗漏后，弃ddH2O，用吹风机吹干胶板，之后置于通风橱中等待其冷却。
④制备分离胶：按配方先向50ml离心管中加入ddH2O、30%丙烯酰胺制胶液、Tris-Hcl-8.8，涡旋使其充分混匀。再依次加入10%SDS、AP液、TEMED,再次涡旋使其充分混匀。
⑤液封：将混匀的分离胶注入胶板至3/4处，之后用200ul枪头吸取无水乙醇进行液封。（缓慢均匀地向胶板中加入无水乙醇）


⑥凝胶：静置30~60min。
⑦制备积层胶：按配方先向50ml离心管中加入ddH2O、30%丙烯酰胺制胶液、Tris-Hcl-6.8，涡旋使其充分混匀。再依次加入10%SDS、AP液（0.1g APS粉末+1ml ddH2O）、TEMED,再次涡旋使其充分混匀。
⑧插梳子：弃胶板中的无水乙醇，注入积层胶，迅速垂直插入梳子。
⑨凝胶：静置30min。
⑩收胶：将配置好的胶置于ddH2O中，放置于4℃冰箱中，待用。
3、配制电泳液、转膜液
电泳液：15g 甘氨酸+3.02g Tris-Base+1.0g SDS 溶于1000ml ddH2O
转膜液：14.4g 甘氨酸+3.0g Tris-Base+150ml 甲醇溶于850ml ddH2O
4、电泳
①拔梳子：垂直将梳子从胶板中取出，排净孔道中的气泡。
②安装胶板：将胶板安装入电泳槽，倒满电泳液。
③上样：用移液枪将制备好的蛋白样品注入孔道中，样品两头各加入3μl、1μl marker（一般按照左大右小的原则）。
④电泳：将电泳槽与Power正确连接。设置电压为70v，电泳30min，蛋白都移动到积层胶底部后（肉眼可见一条蓝色的线）。之后设置电压为110v，电泳直至所需的蛋白条带充分展开，Loading移动到胶底时可结束电泳。
5、转膜
①切胶：打开胶板，将多余的胶切掉，弃去。
②安装转膜设备：取出转膜板，白板朝下，依次放入海绵、三层滤纸、NC膜、胶、三层滤纸、海绵，之后将转膜板夹紧，置于转膜槽中，倒满转膜液。（黑胶白膜：转膜夹白色部分对应着膜，黑色部分对应着胶）



黑胶白膜

③转膜：将转膜槽与Power正确连接。设置电流为300mA，转膜时间根据蛋白的相对分子质量设置(略大于蛋白的相对分子质量)，置于冰中转膜。
6、封闭（5%已过滤脱脂牛奶封闭）
将NC膜从转膜板中取出，放入配制好的牛奶中，置于室温摇床上2h。
7、敷一抗
①配制一抗：按照一定比例稀释抗体，并将配好的抗体置于夹链袋中。
②裁膜：将NC膜多余的部分裁去。
③敷抗体：将裁好的NC膜置于放入一抗的夹链袋中，排除气泡，使一抗与NC膜充分接触，并将夹链袋贴于饭盒壁上固定，置于4℃冰箱过夜。
8、敷二抗
①配制二抗：根据一抗的来源，按照一定比例稀释二抗。
②洗膜：将夹链袋中的NC膜取出，放入PBST中，洗15min。
③敷二抗：将洗好的NC膜平铺于桌面上，将配制好的二抗淋于NC膜上，避光静置50min。
④洗膜：将敷好二抗的NC膜再次放入PBST中，洗15min（避光）。
9、扫膜（避光）
注意事项
1、制备蛋白样品时，稀释蛋白时量取PBS和蛋白时一定保证数据精确，否则浓度测量不准确，会影响最终的实验结果，可采用在枪头上划线的方式。将稀释后的蛋白加入到BCA液中后，要上下左右四个方向轻轻晃动96孔板，使其混匀，并迅速将96孔板放入孵箱中。最后加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液时，要将其打尽。煮样时，注意崩盖损失样品。
2、配胶时，用吹风机将胶板吹干后，一定要等胶板完全冷却后，才能倒胶，否则热量会使得胶迅速凝结而导致花胶。倒分离胶时，不可倒得过满，要保证梳子插在积层胶里而不会触碰到分离胶。液封是用200μl或100μl的移液枪较为合适，且边移动枪边缓缓打入乙醇，切不可用大量程的枪，会因为乙醇注入过快导致胶面不平整。凝胶过程中，切勿移动胶架，可能导致花胶。插梳子时，从左至右推进梳子，将液面的气泡排到边缘；如果垂直插入梳子，会使得气泡进入孔道中，影响电泳的结果。
3、配制转膜液时，先不加甲醇，待第二天用前，加入甲醇并置于冰中，防止甲醇散热挥发。并且转膜液温度过高会影响转膜效果。
4、电泳中，拔梳子时动作要缓慢轻柔，用力过大会损坏孔道。如果拔梳子时孔道歪斜了，可用小镊子轻轻将其归位。上样时，先将样品顺离、涡旋、顺离，使其充分混匀，量取的样品量一定要准确，枪头要垂直进入孔道，匀速将样品注入孔道。电泳时，电泳槽盖盖时注意红色表对红色边，黑色边对黑色边，切勿盖反。如若盖反，样品则会往上电泳。
5、转膜时，依次放入海绵、三层滤纸、NC膜、胶、三层滤纸、海绵，顺序不可放错，否则条带会转到滤纸上去。将胶放在NC膜上后，排净两者之间的气泡。放完最后三层滤纸后，将滤纸与胶之间的气泡排净，使其贴紧，否则可能掩盖条带的趋势。转膜槽盖盖时注意红色表对红色边，黑色边对黑色边，切勿盖反。
6、封闭用的脱脂牛奶，用前配好，用滤纸过滤后才可用，否则会造成条带表面污浊。
7、敷一抗时，将条带放入夹链袋后必须排净膜表面的气泡，使其与抗体充分接触，否则抗体接触不均匀，会影响结果。
8、敷二抗前放入10xPBST中洗膜，是为了出去抗体的非特异性结合。配制二抗及敷二抗时都要注意避光。
实验评价标准：
内参actin的条带大小深浅一致。如果差距较大，说明处理的蛋白样品不均一，则需要重新处理样品。
所需蛋白的条带清晰，形状规整，能较好得反映趋势。

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