做ELISA实验前，事先收集好的标本该如何处理？

非诚勿扰孟非

刚开始接触ELISA的时候，会遇到一些棘手的问题，也容易导致实验出现这样那样的状况。比如收集样本，或者如何处理样本，对新手来说可能会不知所措。
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长长的路

用于ELISA实验的样本有多种类型，包括血清、血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异。合适的样本预处理，是确保ELISA实验准确性的第一步。这里，我们将介绍几种不同样本类型的处理方法：
常规样本处理方式
01 血清
血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。
①使用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置1小时或2-8℃过夜，分离出血清；
②2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，小心收集上层血清。
02 血浆
①使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，2-8℃条件下，以1000×g离心15分钟，小心收集上层血浆；
②常见的抗凝剂包括：EDTA钠盐，肝素钠，枸橼酸钠等。
03 细胞培养上清
将细胞培养上清液吸入离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液。
04 细胞裂解液
①吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，再加入适量的培养基，将培养板上的细胞冲洗干净（悬浮细胞可以省略该步骤）；
②将细胞悬浮液收集到离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心5分钟，再吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次；
③加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂），重悬细胞。添加比例：约1×106个细胞加入150-250μL PBS重悬细胞；
④使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可使用超声波细胞破碎器，超声处理悬浮液来裂解细胞；
⑤2-8℃条件下，以1500×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液。
05 组织匀浆
①用预冷的PBS（0.01M，PH7.4）冲洗组织，除去表面残留的血液或杂质；
②将组织块称重，再切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆；
③加入适量的预冷PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g组织样品对应9mL PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融；
④将匀浆液吸入离心管中，2-8℃条件下，以5000×g离心5分钟，收集上清液。




特殊样本处理方式
01 唾液
在2-8℃条件下，4000×g离心10分钟，以去除杂质。取上清，即可检测。建议使用新鲜的唾液样本。
02 尿液
使用无菌容器收集尿液样本。在2-8℃条件下，1000×g离心15分钟，以去除杂质。取上清，即可检测。
03粪便
以9mL/g的比例，向粪便中添加PBS缓冲液（0.01M，pH=7.4；可选择性添加0.05M EDTA），置于冰上振荡15分钟。在2-8℃条件下，5000×g离心5-10分钟，取上清，即可检测。

样本注意事项
01 样本收集
1. 血液样本采集时，应尽可能避免溶血现象，同时也应避免细菌污染，以免造成假阳性结果。
2. 避免使用高血脂样本。脂质会影响抗原抗体的结合，从而影响测值的准确性。
02 样本保存
样品收集后，若在1周内进行检测，可保存于2-8℃的环境中；若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测）或-80℃（3个月内检测）的环境中，避免反复冻融。实验前，建议再次离心，去除沉淀物。
03 样本稀释
试剂盒的检测范围不等同于样本的浓度范围。如果样品中检测物浓度高于标准品的最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议查阅文献，并做预实验）。
04 样本成分
收集组织与细胞提取液样本时，不建议使用商品化的裂解试剂。裂解试剂中的成分，可能会影响抗原抗体结合，或造成基质干扰，最终影响实验结果。

检验医师

本文重点讲述无菌取样操作，在讨论无菌取样的原因和采集方法之前，必须要理解“无菌的”的这一术语，“无菌”一般用于取样中，意味着取样过程中，避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。
无菌样品的采集基本是为了支持、针对工厂的卫生条件状况的检查结果。
取样前的准备工作
1．包装无菌取样的工具：
拥有正确的采取产品或加工过程的无菌取样器械工具是至关重要的。除非使用合适的采集工具，否则样品的完整性会被怀疑，甚至样品毫无意义。为了避免没有合适的取样工具，建议建立一个无菌取样的分析清单，来收集取样工具。如果可能盛样品的容器在最初进入加工区之前应当被预先标识，像样品号、取样日期、取样人等。这样可以使在不同的工厂条件下的样品取样更为方便一些。附加样品号码一般在样品采集中被正式确定下来，因此不用预先标明。
人员的工具设施，象工作服、发网或消毒处理过的清洁的鞋靴必须具备有助于证明采集者没有污染到食物产品或样品。
2．生产线样品 In-Line Samples：
生产线样品一般是指原材料，原料生产用水、包装材料或其他任何使用在生产线的材料。
生产线样品的采集一般用来确定细菌污染源是否来自于原材料或加工序中的某些地方。
3．环境样品：
环境样品用细菌拭子，（注：细菌拭子样品不能给出/测出微生物的定时结果，因为样品非常小，显著微生物会经常丢失），棉拭子的取样部位一般来自于食品接触面，地板喷溅物。墙壁、顶部管道和检验中考察的其他潜在污染源程序，并且记录可能的联系，在环境样品来源和食物产品的污染方面，可以使样品具有意义，并且是提倡这样做的，例如：
地面喷溅水：工人从有地面污水的地方走过后又回到加工区域吗？
墙壁：墙壁上面和在制品上面有昆害虫吗？
天花板：冷凝物或喷漆有无掉落到产品上或被发现与产品相接触？
4．某些准备
（1）干冰：（有的称为 gel backs）
如果使样品在贮运过程中保持冷却，一些种类的制冷剂是必需的。检查观看干冰袋子是否有接触，如果泄漏可能污染样品，你也可以用湿冰，湿冰可以由工厂提供，然而取样前必须清楚这一点，如果想保持样品冷冻，干冰应在检验前获得。
（2）盒子或制冷皿：
检验员需要贮藏、运输他们的样品，如果样品不需冷冻，那么用一个盒子即可，但如果样品需要冷却，一个标准的制冷皿或保温箱是必须使用的，一般来讲制冷皿随带着一个塑料袋，样品可以放还袋子里，制冷剂象干冰，等可以放置在袋外，这样样品被冰污染的可能性就被避免了。
（3）灭菌容器：
从塑料袋到灭菌的加仑漆桶，可以用于有锐利边面的产品如蟹、虾等。
（4）取样工具：
取样工具包括：茶匙、角匙、尖嘴钳、fovceps tongs 量筒和烧杯，工具的类型一般由取样产品来决定。
所有取样设施和容器的灭菌日期应当被检查、灭菌时间应当在仪器设施的标签和包装上标明，一些仪器设施可以在当地实验室灭菌处理或购买灭菌仪器，在当地实验室灭菌的仪器设施一般可以保持至少两个月，过期后设施必须重新灭菌。
（5）灭菌手套：
灭菌手套在采样中并非必须启用，如果一个产品在样品收集过程中必须被接触，那么最好让工厂生产线的工人来做（加工处理产品的工人），将样品放入收集容器中，既然工人在生产过程中处理接触产品，那么我们就不能认为他们对产品又有附加的污染。
当用手套时必须用一种避免污染的方式戴上，手套的大小必须适合工作的需要。
（6）无菌棉拭子：
一般用于拭取仪器设施和工厂环境区域，使用棉拭子一般有一个正确的程序，打开棉拭子剥掉表皮，然后必须小心的放在试管头上，注意不要沾染棉拭子的外端；下一步擦拭要取样的部位，像案板头或顶部管道，然后从试管头上小心翼翼地将拭子放入——将其全部堆入直到试管中部。
（7）灭菌全包装袋：
袋子必须购买灭菌的，使用时只需撕掉封头，用提供的地方张开袋子，将样品放入，然后将袋子顶端卷起，用线绳扎实牢；底部应当折叠两次，以便线绳不会穿透塑料袋，导致样品泄露。
当样品收集时，样品采集时的条件例如产品的温度、地点等，连同扦样样品号唛头，一并记录入检验员的注释说明中，取样的样品可以从样品号、采集日期、附加样品号，最初调查人和其他鉴别信息事区分。
当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：千万别污染样品。
这需要样品采集人非常小心地采集所有附加样品，确保不违反这条规则。

取样方案
微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。
一般说来，进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样；进出口贸易合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定抽样方案。目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案，有时也可参照同一产品的品质检验抽样数量抽样，或按单位包装件数N的开平方值抽样。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。
ICMSF 推荐的抽样方案
ICMSF 的采样设想及其基本方法用于分析所抽样品的数量、大小和性质对结果会产生很大影响。在某些情况下用于分析的样品可能代表所抽“一批”（lot） 样品的真实情况，这适合于可充分混合的液体，如牛奶和水。
在“多批”（ Lots 或“ batchers”）食品的情况下就不能如此抽样，因为“一批”容易包含在微生物的质量上差异很大的多个单元。因此在选择抽样方案之前，必须考虑诸多因素（ ICMSF，1986），包括：
——检验目的；
——产品及被抽样品的性质；
——分析方法；
ICMSF 提出的采样基本原则，是根据（1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同。（2）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：①降低危害度；②危害度未变；③增加危害度，来设定抽样方案并规定其不同采样数。目前，我国也已采用此法作为国家标准。在进行详细叙述之前，先解释四个代号：
n：系指一批产品采样个数。
c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。
m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。
M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。

ICMSF的采样方法
有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。
ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、с及 m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。
（1）二级抽样方案。自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。
检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。以生食海产品鱼为例n=5，c=0，m=102，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。
（2）三级抽样方案。设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。例如：冷冻生虾的细菌数标准n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许≤3个检样的菌数是在m到M值之间，如果有3个以上检样的菌数是在m到M值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。
（3）ICMSF 对食品中微生物的危害度分类与抽样方案说明
为了强调抽样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的抽样计划与食品危害程度相联系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。
ICMSF 是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下面结合表1加以说明。




注：表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。
“无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。
“增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。
根据上表15种情况的举例，1-3可用三级法，4-5可用二级法来判定是否合格。
考虑到以上15种情况，分别设定不同的取检样数及检样污染数，在1-9例种检样需采5个（n=5），而污染检样数设定为c=3，2，1。在10-15例用二级法则不得检出该致病菌c=0。例如冷冻食品，细菌数按例2，大肠菌按例5，金黄色葡萄球菌按例8，沙门氏菌按例11的二级法判定。
对食品处理应酌情考虑，例如生肉火腿中的金黄色葡萄球菌，被腐败菌所抑制，不易发生食物中毒，适用例7和例8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌没有抵抗力，则易发生食物中毒，适用例9。加热盐腌的火腿，水分活性为0.86以下，金黄色葡萄球菌有增殖的可能性，因此适用例9。沙门氏菌水活性在0.94 以下不能繁殖，适用例11，如上所述，应根据各种食品的危害度进行设定。
ICMSF方法是以二级法、三级法和抽样的概念为基础，再将微生物的知识加进来，则可以提出各种食品的微生物标准。如表2。
为了安全，冷冻生虾加热吃，减少危害度适用例1、4、10。冷冻加工虾，为了不加热就食，在解冻中有增强危害度的可能性，适用例3、6、9、12，对象微生物特别指定金黄色葡萄球菌肠毒素，两者虽菌数限量是相同的，但情况有所不同，
分别适用c=3，c=1，因此不依靠菌数限量，而用合格率来控制。

（4）随机抽样方案
在现场抽样时，可利用随机抽样表进行随机抽样。随机抽样表系用计算机随机编制而成，包括一万个数字。其使用方法如下：
①先将一批产品的各单位产品（如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批 600包的产品编为 1、 2…600。
②随意在表上点出一个数。查看该数字所在的行和列。如点在第48 行、第10列的数字上。
③根据单位产品编号的最大位数（如 A1，最大为三位数），查出所在行的连续列数字（如 A2 所点数为第 48 行、第 10、11 和 12 列，其数字为 245），则编号与该数相同的那一份单位产品，即为一件应抽取的样品。
④继续查下一行的相同连续列数字（如按A3、即第49行的第10、11 和12列的数字，为608）。该数字所代表的单位产品为另一件应抽取的样品。
⑤依次按A4所述方法查下去。当遇到所查数超过最大编号数量（如第50行的第10、11和12列的数字为931、大于600）则舍去此数，继续查下一行相同列数，直到完成应抽样品件数为止。

抽样方法
确定了抽样方案以后，抽样方法对抽样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。抽样必须遵循无菌操作程序，抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。抽样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。常见的抽样方法有：
1．直接食用的小包装食品：
尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。
2．统装或大容器包装的液体食品：
（1）抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；
（2）抽样时应先将抽样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样品，装人灭菌盛样容器的量，不应超过其容量的四分之三，以便于检验前将样品摇匀；
（3）取完样品后，应用消毒的温度计插入液体内测量食品的温度，并作记录。尽可能不用水银温度计测量，以防温度计破碎后水银污染食品；
（4）如为非冷藏易腐食品，应迅速将所抽样品冷却至0-4℃。
3．统装或大容器包装的固体和固体食品：
（1）每份样品应用灭菌抽样器由几个不同部位采取，一起放入一个灭菌容器内；
（2）注意不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。
4．统装或大容器包装的冷冻食品
（1）对大块冷冻食品，应从几个不同部位用灭菌工具抽样，使之有充分的代表性。
（2）在将样品送达实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。
5．生产过程中的抽样：
（1）划分检验批次，应注意同批产品质量的均一性；
（2）如用固定在贮液桶或流水作业线上的抽样龙头抽样时，应事先将龙头消毒；
（3）当用自动抽样器取不需要冷却的粉状或固定食品时，必须履行相应的管理办法，保证产品的代表性不被人为地破坏。

样品的标记、保存和运送
抽样过程中应对所抽样品进行及时、准确的标记；抽样结束后，应有抽样人写出完整的抽样报告，使样品尽可能保持在原有条件下迅速发送到实验室。

1．样品的标记
（1）所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。
（2）当样品需要托运或由非专职抽样人员运送时，必须封识样品容器。

2.样品的保存和运送
（1）抽样结束后应尽快将样品送往实验室检验。如不能及时运送，冷冻样品应存放在-15℃以下冰箱或冷藏库内；冷却和易腐食品存放在 0-4℃冰箱或冷却库内；其他食品可放在常温冷暗处。
（2）运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。必要时可于途中补加冷却剂或冷冻剂。
（3）如不能由专人携带送样时，也可托运。托运前必须将样品包装好，应能防破损，防冻结或防易腐和 冷冻样品升温或融化。在包装上应注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字样。
（4）作好样品运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字。

同花顺

谢谢分享，受教了

大力水手

这个问题由武汉新启迪生物来为您解答。
做ELISA实验，在处理样本前应该先了解收集样本的注意事项。
【标本收集注意事项】
1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2.血清和血浆避免使用溶血，高血脂标本。
3.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4.标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-80℃电冰箱内，避免反复冻融。  
5.可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) 。
6.收集标本，尽量做到双份的用量，避免一次实验失败，重复实验时标本缺失，从而耽误实验进程。
7.收集标本时，应该做好防护措施（比如戴手套，口罩，护目镜等），认为所有标本都具有一定的潜在危险性。
8.样本处理应该在生物安全柜里面，并且正确使用生物安全柜。
样本正确的处理方法应该是这样的：
【标本处理办法】
1.血清：将采集的全血静置冰箱4℃过夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
2.血浆：用EDTA，枸橼酸钠，肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000rpm离
    心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）
    保存。
3.组织匀浆：切取组织块，0.01MPBS中过洗一次；按照1G组织加入5-10ml组织蛋白萃取试剂的比例，在冰水中匀浆。匀浆完成后，5000-10000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
4.细胞培养上清：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
5.尿液，腹水，脑脊液等：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃3-6个月）保存。
注：样品稀释的一般原则
用户须查阅相关文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。样品的稀释应有详细记录。
了解更多问题，可加Q1317618842