蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）实验原理及操作步骤详解

病理医师

蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）
实验原理及操作步骤详解
    之前一致没腾出时间整理一篇自己实验室的WB具体步骤，这几天整理了一下，供大家参考。
实验介绍
蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学 George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 Analytical Biochemistry 中首次被称为 Western Blot。最开始做印迹的是一个叫 Southern 的科学家，但印迹的对象是 DNA 链，他把这种技术称为 Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对 RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为 Northern 和 Western。
实验原理
Western blot（也称为蛋白质免疫印迹）是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 来分离指定样品中包含的各种蛋白质，然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上，接下来将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中，未结合的抗体被洗掉，只留下与目标蛋白质结合的抗体，最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。由于抗体仅与目标蛋白质结合，因此一般只能看到一条清晰的带，条带的粗细对应于蛋白质量。通过分析特定反应的位置和强度，可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。由于凝胶电泳的高分辨率和免疫的强特异性和高灵敏度，Western印迹分析可检测低至1ng的靶蛋白。该方法广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等分子生物学领域。   



实验材料
蛋白质样品；
丙烯酰胺、SDS、Tris-HCl、β-巯基乙醇或DTT、ddH2O、甘氨酸、Tris、甲醇、PBS、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、ddH2O、考马斯亮兰、乙酸、脱脂奶粉、硫酸镍胺、H2O2、DAB等；
电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、硝酸纤维素膜、移液枪等；
实验步骤
1.准备样品，进行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后不要染色，直接进行转膜。（SDS-PAGE样本制备及电泳参见号内文章《SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量protocol》、《SDS-PAGE电泳及Western试剂配制protocol》）
2.转膜：转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。将切好的硝酸纤维素膜置于转膜液中浸 20 min才可使用。
在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）。在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起再垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。   
切胶，按Marker指示和目的条带的位置切胶(注意将胶切角做记号)，将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中15分钟，小心的将胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。整体顺序为“黑色电极—海绵—3层滤纸—凝胶—PVDF膜—3层滤纸—海绵—红色电极”。
将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h（可能会有比较大差别，我们实验室一般200 mA（约70 V）转膜15 min就可以了，20 min有的转过了，有次转了1小时，全都投过去了）。
转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
3. 膜封闭和抗体孵育
1) 转膜以后，用10ml的1×TBST室温洗膜5分钟，洗三次。
2) 5ml奶粉封闭液（或3%BSA的TBS）室温孵育2 h或者4℃平缓摇动过夜。
3) 10ml的TBST洗膜3次，每次5分钟。
4) 加入5ml一抗稀释缓冲液（抗体根据说明稀释），室温2 h或者4℃平缓摇动过夜，回收一抗，按5μl/ml一抗液加入叠氮钠（可抑制细菌生长）4℃保存（不常用的抗体可-20℃长期保存），可重复使用！   
5) 10ml的TBST洗膜3次，每次5分钟。
6) 加入二抗（一般为1：2000稀释），室温平缓摇动1h。
7) 10ml的TBST洗膜3次，每次5分钟。
4. DAB显色（或荧光标记的二抗孵育后，直接扫描荧光）
1) 显色步骤：配制DAB显色液，将膜放置于DAB显色液中，待条带显色清晰后，取出膜，自来水冲洗终止显色即可。
2) 分享一个经过验证、好用的DAB配方（也可在试剂公司购买现成的DAB显色液）         
       Western DAB显色液配方：1M Tris-HCl(PH8.0) 200μL   
                        5mg DAB         
                        水9.8mL         
                        用前加H2O2（30%）3.5μL

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