论流式细胞仪在国内的现状前景及发展阻碍？

风云

流式细胞仪在国外已有近二十年的发展，及5年以上的商业应用。与多科研机构在进行相关研究。其准确高效的性能是许多传统检测手段无法比拟的。现如今，流式细胞仪在国外许多领域已经有应用，尤其在医疗领域技术相对成熟，应用比较广泛，并且该检测手段也是将来发展的趋势但是它也是成本相对高的检测手段之一。流式细胞仪在中国也有少量的研究及应用，不知道它在中国的发展前景，和发展的主要阻碍。
原文地址：https://www.zhihu.com/question/27182103

长长的路

在聊这个问题之前，我们得对于流式细胞仪和流式细胞术有一个基础的认知。
什么是流式细胞仪呢？

流式细胞仪是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的细胞的计数和分选技术，样品的液流技术，计算机对数据的采集和分析技术等。
流式细胞仪以流式细胞术为理论基础。流式细胞术指的是检测流动细胞的一种技术，能在细胞流动的状态下，快速检测细胞或者颗粒物的特异性指标。



简而言之，流式细胞仪依托于流式细胞术而诞生，能在短时间内检测并分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，并进行多参数定量分析。
那么流式细胞仪由什么组成以及作用是什么呢？
除了电源外，流式细胞仪主要由这四部分组成：

机关源和光学系统
光电管和检测系统
计算机和分析系统
流动室和液流系统

其中流动室是流式细胞仪组成的核心部件，这四个部件让流式细胞仪得以运转，共同完成了信号的产生和转换，以及传输的任务。
流式细胞仪最常用于免疫表型分析，可以同时分析免疫细胞混合群体的多个参数。
流式细胞仪可以用来检测细胞表面以及胞内的各种标志，对细胞进行分群鉴定以及各种蛋白表达量高低的比较。
不仅仅是免疫细胞，其他的如成纤维细胞、肿瘤细胞、干细胞等都可以用流式细胞术进行检测分析和分选。
二、通过标记Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相关基因，流式细胞术可用来检测细胞的增殖以及凋亡。
三、可用来分析细胞周期。细胞核DNA含量随着细胞增殖周期时相的不同而发生变化，用DNA染料进行染色，DNA含量多，荧光信号强，DNA含量少，荧光强度低。
在肿瘤学研究中尤其常用，可以用于判断药物对肿瘤细胞影响、肿瘤的生长速度等。




以上可以说是分析型流式细胞仪的主要功能最常用的功能了。
那它在国内的具体发展情况是怎样的呢？

流式细胞术目前主要应用在科研、生物产业及临床检测领域。如抗体开发、细胞治疗、肿瘤免疫等都需要流式细胞技术。
客观来说，流式细胞仪在国内的发展和国外具有一定差距，毕竟我国医疗器械行业起步较晚，从应用角度来讲，尚处于技术推广期。
但是我国多年来一直大力扶持医疗诊断行业，细胞治疗也是未来医学的三大支柱之一，流式细胞仪在医疗器械市场也有着巨大的成长空间，整体发展速度快，总体来说是属于未来可期的状态。

从市场角度出发，尽管流式细胞仪在科研市场已经相对饱和。除仪器的换代升级以外，主要增长点会是小型化个人化机器从平台进入独立实验室，发展方向还是以性能与易用性为主。
但是随着国内日渐兴盛的创新药物开发，作为基础的细胞分析工具，流式细胞仪也被广泛应用于包括抗体药物、小分子药物、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Car-T）以及PD1等抗肿瘤药物开发中。
面对激烈的药物开发市场角逐，大家对流式细胞仪性能要求也提出新的要求。高通量、快速检测、自动化、多重分析等等。

而在临床市场，则和科研市场的情况有所区别。

流式细胞仪是在细胞治疗领域的一个重要的研究和研发依托，不但具有精确稳定的分析性能，而且其特有的单细胞水平分析能力在细胞治疗领域中发挥不可或缺的作用。
临床市场则得益于试剂准入门槛的降低，流式细胞仪将会在临床市场加快普及速度。而且因为免疫学的发展，流式细胞仪的作用将会越来越大。
虽然现在流式细胞仪的操作门槛比较高，但是也有非常优秀的产品，让流式细胞仪能规模化使用成为可能：


比如赛多利斯旗下的产品iQue 3高通量流式细胞仪能够在5分钟内快速完成96孔板的检测与分析，能够在同一孔中同时对细胞、微球和分泌蛋白进行多重分析，借助“气泡分隔”快速采样和智能分析软件，能够实现在检测的同时提供出分析数据。
iQue 3是 iQue Screener PLUS 系列一款最新的先进流式细胞仪，最大程度缩短了从设置到获取数据直至分析的操作时间，可帮助使用者快速从样品中获取可执行的结果。

系统最新集成了功能强化的清洗站，可监测系统试剂使用和消耗情况，确保系统中始终有充足的试剂，完成整个实验。
研究人员可以通过这一平台进行高内涵、多重检测，从而对微孔板中每个孔进行免疫功能评估，包括细胞免疫表型、细胞健康和分泌蛋白（细胞因子）分析。
集成的 ForeCyt 软件通过快速的数据可视化和解读，消除了多参数数据创建相关的分析瓶颈。
剖面图、自动生成的 IC50/EC50 曲线和分析模板等工具，可在实验结束时更轻松地执行分析。
利用先进的 Panorama 分析功能，可立即分析多个孔板的数据，即使不是同一天做的实验。所有这些工具可将数据分析时间从数日减少至数分钟之内。

iQue的高通量、快速检测以及智能分析功能为创新药物开发提供有力工具：

1.精简抗体开发流程：

目前，全球超过5950个抗体药物的靶点共计992个，也就意味着针对同一靶点有多个抗体药物竞争。
iQue®能够同时检测IgG滴度、细胞健康和细胞活力，检测通量大、速度快、最小上样量仅需1微升，实现从抗体筛选、到候选细胞功能分析，以至包括细胞株开发等生物工艺优化过程中全面加速和简化流程。
相比于传统ELISA方法，iQue不需要大量靶蛋白包被样品板，且能够同时检测多个抗原的结合，更重要的是对细胞表面天然构象靶蛋白进行筛选。
而相比于传统流式，iQue能够在20 分钟内完成 384 孔板的分析，仅消耗三分之一的样品，在同样的时间内筛选更多(4 倍)的抗体克隆。

2.小分子药物筛选:

尽管制药技术已经扩展到细胞疗法、基因疗法、RNA干扰（RNAi）、CRISPR等新型模式，小分子药物仍然是新药研发的一大支柱，除了备受关注的“不可成药”靶点的小分子配体研究，基于表型的药物筛选也随着日益复杂的细胞模型的建立而复兴。提高表型筛选的通量及效率成为加速小分子药物研发的重中之重。
iQue® 高通量流式细胞仪通过高通量悬浮细胞筛选填补了这一空白。
iQue®3能够完全兼容1536 孔板，且每个孔中只需采样几微升，大大节约了试剂成本。
先进的自动化技术可迅速将样品递送至检测器，iQue® 是基于细胞和微球筛选的新一代流式细胞仪，通过高通量悬浮细胞筛选，将传统耗时的低通量流式细胞术转变为真正的高通量方法。

3. Car-T疗法开发:

赛多利斯iQue®高通量流式细胞仪作为一种高效、便捷、多参数的定量细胞分析工具，为检测CAR-T细胞的扩增和持久性、以及治疗反应提供解决方案。
与现有的方法比，它具有五大优势：
速度快：利用最快的孔板采样，整合分析，多重免洗测定和创新的数据精简技术来突破容量瓶颈。
微量化：所需样本体积小，上样量可低至一1微升，节省试剂和宝贵的细胞。
内容丰富：对悬浮液中的细胞、微球和分泌蛋白进行高容量、多重分析。
易操作：简单、可扩展、多用户环境，配置易于实现的自动化、综合分析和可视化工具。
洞察分析结果：链接信息，运行方案，创造知识，做出更好的决策。


希望我们的分享，能对您有所帮助。

参考链接：
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高通量 多参数 非标记 无损检测！



●实时监测细胞状态，包括细胞浓度、数量，活力，大小（电直径），追踪细胞的分化衰老凋亡和癌变
●适于所有类型的单细胞(肿瘤细胞，白细胞、红细胞等哺乳动物细胞、细菌、病原体、酵母、藻类、浮游生物、花粉、精子等)
●标准化测试：高通量（＞1000cells/s），高重复性、高精确度
●用户体验友好，操作简单易上手
微流控阻抗流式细胞仪（IFC）通过整合微流控技术、电阻抗技术与流式细胞术，能够在微流体精确参考条件下，实现流动态单细胞的连续、无损阻抗检测。与传统的单细胞检测方法相比，微流控阻抗细胞仪具有非标记、多参数、低污染和检测速度快等显著优势，可大大减少时间消耗并降低成本，为细胞的种类鉴别与状态检测提供了强有力的工具。
工作原理：
基于细胞膜的电特性（膜电容和膜电阻），当不同大小和活性的细胞或颗粒随悬浮液流经广频（0-30 MHz）交流电场时将产生不同的电阻抗信号，经解析获得细胞的浓度、数量、活性及大小等信息。如下图所示：A）细胞在不同频率的交流电场中的检测结果：低频电场反映细胞的体积特性即电直径，高频电场反映细胞的介电特性即细胞活性；B) 微流控芯片；C）细胞电阻抗信号（蓝色实部即电阻信号，绿色虚部即容性电抗信号），细胞膜完整性决定容性电抗的大小，故可通过虚部信号来区分活细胞和死细胞，最终以阻抗相位角-振幅散点图反映出来。



微流控阻抗流式细胞仪信号的采集和转导

高精确度：




图1 酵母活性的检测结果显示IFC法与PI荧光染色法无差异（y = 0.9572x + 2.2259  R² = 0.9957）



图2 BL2细胞浓度的测量结果显示IFC与Neubauer血球计数板良好总方法之间的技术无差异（y    = 4E+0.6x-0.829, R² =0.9967）



图3 U937人淋巴瘤细胞活性对不同纳米材料的剂量响应曲线表明IFC法与TB染色法的结果一致



图4 感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞大小变化表明IFC法与Countess™自动细胞计数仪的分析结果无差异（R2=0.901）

典型应用：

●细胞大小和形态研究
●细胞活力测定
●毒理学研究
●细胞分化
●细胞凋亡
●在线细胞监测
案例分享（部分）：

◆分析肿瘤细胞活力及凋亡进程
肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。微流控阻抗流式细胞仪可高通量（>1,000个Cells/s）、非标记测量每个细胞的生理特性，通过阻抗数据（相位-振幅散点图）快速识别和量化肿瘤细胞培养物的活性和浓度，评估肿瘤细胞对凋亡诱导剂、细胞毒剂的剂量反应或分化、凋亡进程。





不同培养时期BL2细胞的阻抗相位和细胞活力的变化



Staurosporine诱导下BL2细胞的凋亡过程

◆评估酿酒酵母活性
啤酒酿造过程中酵母菌种、酵母接种量、酵母使用代数、发酵工艺条件等都会影响啤酒的风味。微流控阻抗流式细胞仪高通量、快速可靠测定细胞活力，细胞大小的变化，评估温度、渗透压以及对产物、底物等培养条件对酵母菌的影响，进而优化发酵工艺。



啤酒酿造过程中酿酒酵母密度、活性及酒精浓度的变化

◆感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞的活性变化
基于昆虫杆状病毒表达系统自身的特点和优势，目前已被广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域。微流控阻抗流式细胞仪可帮助在昆虫细胞BV感染过程中检测细胞活力变化、确定多重性感染（MOI）范围、筛选理想的表达条件并预测BV昆虫细胞系统中收获胞内蛋白的最佳时间。如案例所示，Sf9昆虫细胞在感染杆状病毒后的数小时（hpi）内，微流控阻抗流式细胞仪所获得的相位-振幅散点图可明显分离出三个细胞类群，分别是活细胞（viable）、感染晚期（LPI）和死细胞（dead）类群。感染48hpi后，活细胞的阻抗振幅降低（细胞萎缩）且数量逐渐减少，直至99hpi细胞全部死亡。感染晚期（LPI）细胞类群出现在较低相位，这部分细胞在0-60hpi逐渐增加随后减少直至消失。





感染杆状病毒（BV）数小时内Sf9昆虫细胞活性的变化

◆评估胰腺肿瘤细胞对化疗药物的敏感性
肿瘤患者来源的异种移植(PDX)是进行化疗药物敏感性和毒性评估的有效手段，对预测化疗疗效十分重要。在药物处理下分泌到培养基中的亚细胞凋亡小体(ABs)和微泡（MVs），可作为药物敏感性的标志物。然而由于ABs复杂多样，很难确定每种AB型的适配荧光染料并预估ABs对不同染料渗透动力学的依赖性，因此利用流式细胞仪量化细胞分解过程存在极大的挑战。微流控阻抗流式细胞仪作为一种测量单细胞电生理学特性的有效工具，不仅免除了费力耗力的细胞收集和染色标记过程，还可避免因染色不当所造成的细胞凋亡，可在不同的肿瘤微环境模型和药物类型下高通量、非标记、快速无损检测ABs表型并追踪细胞凋亡过程，进而准确评估药物敏感性和毒性。





不同浓度的吉西他滨诱导下PDAC细胞系的凋亡变化（显微镜镜检vs.流式细胞术vs. IFC法）

◆评估纳米材料毒性
纳米材料广泛应用于工业、农业、食品、日用品、医药等各个领域的同时，已不可避免地给我们的环境和健康带来不利影响。因此，为确保纳米材料的安全性，促进纳米技术的发展，进行纳米材料毒性评估十分必要且紧迫。微流控阻抗流式细胞仪可以非标记、高通量、快速评估纳米材料的毒性，避免假阴性或假阳性的检测结果，是一种可靠且经济高效的检测方法。



U937细胞对NM-300K（Ag，100μg/ mL）的急性毒性效应

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在前几期的流式细胞术知识分享中，我们为大家介绍了仪器、试剂以及应用方面的知识。今天，我们将介绍最后一部分——数据分析。




目前，传统的双参数直方图(点状图)“门控”分析方法仍然被频繁使用。但随着流式细胞术实验的参数和复杂性的增加，新的聚类数据分析方法得到使用，比如PCA、SPADE以及tSNE等，这些新的数据分析方法使研究者能够从流式细胞术高维数据中提取有用的信息。

FCS文件标准

FCS文件格式创建于1984年，用于标准化流式细胞术列表模式数据文件。所有流式细胞术数据文件都有“.fcs”文件扩展名，以被任何的流式细胞术分析程序读取。目前，FCS文件标准是FCS 3.1。

常规流式细胞术分析

常规的流式细胞术分析，即选定目标细胞群所在区域（门控），并根据实验需要，选择参数对选定的细胞群进行分析。例如，辅助T细胞群先根据CD3+、CD4+的表达被选定。之后，再根据活化标记物（比如CD25）的表达选定活化细胞群所在区域，进行活化分析。




常规流式细胞术分析中的“门控”


除了与流式细胞仪配套的软件之外，还有多种商业化计算机程序能够用于流式细胞术数据的分析。目前，最常用的流式分析软件有FlowJo、WinList、FCS Express、Kaluza和WinMDI。




细胞周期分析

细胞周期分析软件程序使用倍性建模来确定由 DNA 直方图表示的细胞周期阶段。ModFit LT是一个专门用于这类分析的程序。此外，FlowJo有一个细胞周期分析模块。

高维数据分析

使用常规流式细胞术分析方法对高维数据进行分析是繁琐的，会消耗大量时间，因为高维数据往往含有14个以上的参数。另外，使用常规的“门控”方法难以确定多个标记之间的关系，可能会导致目标细胞群的丢失。目前，已有多个新的分析工具可用于高维数据的分析以及可视化，比如SPADE (Spanning-tree progression analysis of density-normalized events)，tSNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)，PCA (Principal component analysis)，以及FLOCK (FLOw clustering without K)。算法上，tSNE与PCA相似，但是tSNE能够比PCA识别出更多的共分离特性。tSNE可作为FlowJo和FCS Express的插件使用。




此外，Cytobank是一个高维数据的云端分析系统，分析参数可达30个以上。在这里，用户通过上传数据并选择相应的分析项目进行数据分析。Cytobank的聚类、降维和可视化工具充分利用云计算的可伸缩性，可快速进行大量分析。

继续前进

流式细胞仪现在市场上主要以国外的仪器为主，具体说是BD和BCI两家独大，国家的品牌很少，这两年有好几年国内厂商都开始做了，但市场份额可以说是微乎其微，甚至不能养活自己的团队，国内使用流式细胞仪的都是三甲高端医院，三甲医院一般都不差钱，敢开流式项目的一般都不愿意选择国内的品牌，总的来说，前途是光明的，道路是曲折的。

长长的路

2月10日有更新
————————以下是答案——————
先说科研市场：
流式细胞技术作为一个科学研究的一个手段，在国内的业务增长已经进入到稳步上升阶段。分析仪方面个人化小型分析仪的市场刚近两年刚被点燃，前期是Accuri C6铺路，CytoFlex以高性价比特征入场后收割果实，Millipore以Guava和Acea以Novocyte分食剩余市场。目前这个细分市场仍能保持年增长率30%以上，因此吸引了更多厂家进场，如美国的Cytek，其主营业务原本是为美国市场的存量BD用户提高供性价比的改装升级服务，高层以华人为主，发现了中国市场的巨大潜力，所以在2015年开始涉水中国市场，推出CytoFlex的对标产品Athena，也是主打性价比和小型易用。
分选仪方面，近几年分选仪开始放下身段，从原先普通用户难以企及的高价位使用复杂的形象逐渐分化出个人化易用型流式分选仪。BD公司作为目前流式市场的最大供应商，最先主动拓展个人化小型分选仪的细分市场，这个市场要求产品必须方便易操作、上手门槛低、人人都能轻松使用。目前这个细分在欧美已经成熟，主要用户是Biotech和Biopharma类公司，以及对流式分选使用较多的Individual lab；但在国内情况不同，一来公司数量少且大都还在早期成长阶段，产品和药物开发还没发展到对流式大量需求，二来是funding问题，有足够经费自己购买一台分选仪的individual lab是少之又少。所以这部分市场需求在国内与core facility相比几乎可以忽略。但BD公司在国内基本上复制在欧美的策略。其最早推出的产品是FACSJazz，声称其是一款个人型易操作的流式分选仪，但Jazz是基于Influx简配而来，无奈受限于原理和设计，操作依然非常繁琐，普通使用者面对这样的仪器还是无所适从，因而Jazz名不副实，是一次失败的试水，从2011年推出到2015年黯然停产退市。Biorad有款分选仪产品S3也是针对这个细分，价格做到100万人民币以下，在分选仪市场算是比较亲民了，只不过完成度欠佳及国内渠道缺乏的原因，使得它在国内没有真正被推广开。
——————2月10更新————————
真正点燃个人化分选仪市场的产品来自索尼公司，没错，索尼大法好的索尼。索法进军生命科学是从2010年收购美国流式仪器制造商iCyt Mission Technology开始的，2012年推出真正第一台索尼自主研发的流式细胞分选仪SH800。这款产品充分利用了索尼在光学和机电领域一直以来的优势，将传统分选仪上手动设定光路和液流革新为全部自动设定，如此一来便充分解放了操作员的双手和时间，因此在欧美这些人力成本高的地区很受欢迎，且产品完成度高，操作界面设计人性化，甫一推出便名声大噪，很快在欧美日本这些地区推广开来，到现在历经三代产品而更成熟稳定，配置也愈加丰富。不过相较于BD和Beckman的传统分选仪产品线，SH800在通道个数和分选路数上的劣势使得它无法成为core facility采购第一台分选仪时的首选，因而SH800更受PI的个人实验室及医药和生物科技公司欢迎，但也有很多core facility在已有高配分选仪之后配置一台SH800，用于将不同类型的应用进行分流以便于管理。
当个人化分选仪市场如火如荼之际，BD和Beckman自然也不甘人后。BD在Jazz试水失败退场之后于2016年6月发布FACSMelody，同样定位个人化操作和易用。这款产品基于Aria二代的平台重新设计而来，核心部件基本不变，软件风格类似于FACSVerse上的FACSuite。Beckman的步伐稍慢，据称会在2017年推出对标产品，不过是由苏州赛景陈永勤博士团队（CytoFlex研发者）主要开发。因此会于2017-2018年与BD和索尼在此战场上正面厮杀。如果其仍然采取类似CytoFlex的低价策略，那么又将在流式市场掀起一阵腥风血雨，并且会很快拉低整个分选仪市场产品的入门门槛。届时整个分选仪市场会向中低端倾斜，将可能大批出现价格50-100万人民币的流式分选仪。而受惠于此，很多在原先情况下由于经费不足或需求频次不高的个人实验室和科研机构及生物科技公司将可以拥有自己的分选仪器。
除了个分选仪的个人化趋势之外，这个市场正在分化出越来越多针对特定用途的产品，比如美天旎的Tyto采用一次性卡盒主要面向临床市场、Thermo与Cytonome开发的小型的只能检测GFP的单色单路分选仪、日本的On-Chip分选仪低速温和分选、以及市场上很多家专门用于分选CTC的分选仪等等。
待续。