2020 年诺贝尔化学奖授予 CRISPR 基因编辑，这项技术将如何影响我们的未来？

奋斗的小鸟

2020 年诺贝尔化学奖已授予开发 CRISPR 基因编辑技术的 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna。



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继续前进

两次错过诺奖级发现！但这位科学家说他并不后悔


出品：科普中国
制作：张昊（大阪大学）
监制：中国科学院计算机网络信息中心 @中国科普博览
诺贝尔化学奖不愧有理科综合奖的“美誉”，今年又奖给了生物相关技术领域的科学家。
法国女科学家埃玛纽埃勒·卡彭蒂耶和美国女科学家珍妮弗·安妮·道德纳因“基因魔剪”勇夺桂冠。




△来源：诺贝奖官网

国人在为同样从事这一领域研究的华裔学者张锋没能获奖感到惋惜的同时，日媒也在为另外一位科学家感到遗憾。这位科学家早在1987年就窥探到了魔剪奥秘的一角，且在1996年又曾经获得过一次重新审视目标的良机。然而他最终还是把好奇埋在了心里，没有让这颗种子萌发成长。
回顾日本微生物学家石野良纯的研究生涯，那些与基因魔剪擦身而过的瞬间，只能说冥冥之中自有天意。
到底是什么原因让比世人早大约十年闯进这个领域的他最终没能成为掌控魔剑奥义的第一人？他怎么看待这项技术的发展历程？他到底有没有遗憾和后悔？通过他在多次采访中向记者吐露的心声，我们能有机会一探究竟。
1987年，当时在大阪大学微生物学研究所担任研究员的石野良纯正在如痴如醉地研究大肠杆菌中某些酶的功能，这些酶作为蛋白质，是由细菌的DNA编码合成的。因此为了研究酶，石野还需要对编码这些酶的基因序列进行解析。那个时代不像现在一样拥有可以迅速解析特定基因序列的技术，石野的工作十分艰苦，好在最终解析获得了成功。
然而，在得到结果的同时，石野发现在大肠杆菌基因组的某个片段中，有一些来回重复的碱基序列，它们的排列似乎毫无意义，但又极具规律。
石野后来回忆称：“当时面对的形势是，本来想要进行的课题已经取得了成功，论文也完成了。我虽然搞不懂这些奇怪序列到底有什么意义，但它们完全不影响论文的主干。如果妄自在论文中加上一些自己解释不了的怪现象，万一被审稿人问起来恐怕不好应付。”
石野在心里暗自思忖后，还是决定报道这一现象，并在论文的最后五行写下了这样的评论：“虽然其生物学意义尚不清楚，但这种奇特的序列值得深入探讨。”随后，石野前往美国进行细菌和古细菌的相关研究，神秘序列也被他完全搁置。
石野和基因魔剪的第一次邂逅就这样戛然而止，连擦出火花都算不上。这些神秘的基因序列就像古墓大门上的符文，等待着人类的解读。
石野在美国的研究进行得顺风顺水。1996年，他所在的研究团队发表了全球第一个古细菌基因组图谱。然而，神秘的序列又一次不期而至。石野发现这种产甲烷菌虽然并非是和大肠杆菌一样的真细菌，但基因组中同样出现了意义不明的反复序列。
“现在回想起来，当时是个很好的契机，要是能马上把研究重心放在这上面就好了……”，石野面对着前来采访的记者说着半开玩笑半认真的话。“当时手上正好还有很多特别有意思的古细菌课题，我也是沉醉其中不能自拔，根本腾不出手想别的事情。”
就这样，虽然神秘符文在十年后又一次访问了石野，而且是在和真细菌有所不同的古细菌中现身，石野还是没有放心于它们的诱惑。



△来源：Freepik.com

在石野第二次得到符文的暗示之前，其实已经有其他细菌学者注意到了它的普遍存在。
1993年，西班牙和荷兰研究团队相继发现在细菌和古细菌的基因编码中存在奇特的重复序列。然而，这些密码的意义仍然没有人能够读出。看到这里，相信大家都会为石野感到惋惜，哪怕按照1993年计算，他最初的发现也足足领先这个世界67年。
进入21世纪后，世界各地的科学家们不断在细菌和古细菌中发现新的神秘序列，很多人开始意识到这将是重大发现的契机，越来越多的团队加入到了序列解读的任务中。
技术的进步和关注度的增加让序列的最终破译很快就得以实现。2005年，有研究指出神秘的序列或许是一种细菌体内的防御机制。2007年，科学家们最终证明了神秘序列居然是细菌封印在体内的“符咒”，它们是细菌驱除“魔鬼”的“利器”。这充满了中二气息的比喻到底是怎么回事呢？
这要从细菌与其天敌间的斗争说起。细菌或者古细菌在自然界中最大的敌人之一就是噬菌体，它本质上是一种专门入侵细菌的病毒。为了抵御噬菌体的入侵，细菌们进化出了一种类似于人类免疫系统的机制，他们先捕捉到入侵病毒，再将这些病毒的DNA进行分解，使之变成一系列片段。
然后，厉害的一招来了，细菌会把其中一些来自病毒DNA的片段整合进自己的DNA中。在这些片段间，细菌会加入一些重复的碱基编码，例如…CGGTTT…CGGTTT…CGGTT…，其中省略号的部分代表来自病毒的DNA片段，而CGGTT就是细菌或者古细菌基因组中反复出现的神秘序列。



△噬菌体和噬菌体侵染细菌示意图（左），吸附于大肠杆菌表面的噬菌体（右），来源：维基百科“噬菌体”条目

再有同种病毒入侵细菌时，细菌就会将这些病毒的DNA和自己DNA中存储的敌人信息进行对比。一旦比对成功，意识到敌人卷土重来的细菌就会立刻派出一种叫做Cas的蛋白质。Cas蛋白类似于人类免疫系统中的各种“打手”细胞，它像一把剪刀一样，可以将入侵的病毒DNA大卸八块。如此一来，细菌就能在病毒的威胁下安稳生存了。
这就好比古代的人类战士杀死一个敌人就拔下一颗敌人的牙齿做成项链一样，细菌这么做就是提醒自己，千万不要忘记这些曾经入侵自己家园的敌人。在细菌和古细菌数十亿年的进化史中，最初来自于入侵者的基因序列，像封印进身体的符咒，护佑主人的生生世世。



△细菌体内的CRISPR/Cas9系统示意图，来源：诺贝尔奖官网（翻译Ryan）

符咒谜底的揭开，并不意味着基因魔剪技术的立马实现，人类还差一个天才般的发想。
这次获得诺奖的两位科学家（包括同时开展研究的张锋等人），敏锐地意识到细菌身上的这种特质可以为人类精确进行DNA编辑提供可能。她们将细菌中的这套系统进行改良，使之不光可以识别入侵的病毒，还能识别任意的DNA片段，而且在识别后还能对其进行修改，这就是获得今年诺奖的CRISPR/Cas9基因编辑系统。其中的CRISPR代表发现于细菌中的神奇序列，Cas9代表扮演剪刀角色的修剪蛋白。
以前人们想要对特定物种的基因进行编辑，只能将希望引入的DNA搭载于病毒一类载体上，再将其注射入细胞。虽然这种办法确实也能实现基因编辑，但最大的问题是载体并不知道到底该把这段DNA运到什么地方，结果就是出现一系列被随机编辑的DNA。想要找出其中的有用变异，还得再进行筛选，效率非常低下。
如今，科学家们只需要制成与希望编辑的DNA片段相互配对的RNA片段（称为小向导RNA），再让它作为向导，指引Cas蛋白剪切目标位置的基因。小向导RNA可以识别出需要到达的DNA位置，并在此处引导Cas对DNA进行切断。切断后的DNA可以进行突变甚至片段替换，无论哪种形式都可以实现DNA的按需编辑。
基因魔剪的出现，让定向修改基因组中特定基因的难度急剧下降，人类终于拥有了实用化的基因编辑工具。这也是为什么这项技术也被称作是“上帝的剪刀”。



△基因魔剪示意图，来源：诺贝尔奖官网（翻译：栗子）

拥有两次先机的石野终究还是没有去尝试识破咒语，而成功解谜敲开大门的学者们也没能拿走最大的那颗钻石。在基因魔剪的开发过程中，最后拿到王冠的两位科学家似乎不是到得最早的，也不是坚持时间最久的，甚至不是出力最多的，但无疑是最有想象力的。
对此，石野本人也有过非常诚恳的评论：“卡彭蒂耶和道德纳成功将CRISPR/Cas9开发为了一个直接编辑基因的工具，具有巨大的应用价值，获得诺贝尔奖并不奇怪。然而，一路走来的任何一个环节中，每一位科学家的贡献都很难忽略。意识到CRISPR与细菌的免疫系统有关，对其作出预言乃至对其进行实验验证的科学家以及揭开Cas蛋白质结构和运作机理的科学家们，谁最终得到诺奖都不能说奇怪。”
“曾经也有很多人认为，诺贝尔奖对于原创性有着格外的重视，我的发现也有希望占据一席之地。但确实我在当初完全没有意识到自己发现的生物学意义，仅仅指出这可能是一个有意思的发现而已。虽然那并非是我的主要研究目的，但是我仅仅是提出这个发现（就为自己带来了很多的关注）。因此我一方面觉得幸运，另一方面也觉得如果当时能够稍微进行一些深入研究，再有一些像样的预言或者是结论，我现在应该能够更加理直气壮（地说自己在这一系列发现中有过很大的贡献）。”
“不过我还是有句话得讲，在我从事这项研究的那个时代，解析DNA序列的技术非常原始……（此处省略若干技术细节）……我全靠着手工作业，每天工作15个小时，持续了半年之久才完成了当时的研究。按照如今的技术来说，想要解读我30年前那段大肠杆菌的基因序列，只要2天时间。”
“当时真的很辛苦，我主要的研究对象就是解读那段编码特定酶的DNA，当我发现自己进入了CRISPR的区域，完全可以在当时就停下来。可是我觉得既然走了这么远的路，我还是想亲手把它解读出来，看看到底是怎么回事。现在想来，正是这种坚持才让我的名字能够出现在CRISPR开发的历史上，让我能被大家称作是CRISPR的发现人。”石野不无感慨地说。



△来源：Freepik.com

在得知基因魔剪获得诺奖后，记者也第一时间对石野进行了采访。他表示自己非常高兴，甚至是兴奋，并对两位女科学家表达了真诚恳切的祝贺。
“坦率地说，我并没有能够真正地参与到这项成就中，但我并不后悔，古细菌的其他研究同样让我感到快乐，并一直支持着我走到今天。虽然我今年已经64岁了，但有幸在退休之前一年拿到了CREST项目（日本最高级别的科研项目之一，经费在数千万人民币左右），这让我又能再进行五年的研究工作。”
在世人眼里，徘徊在神秘符咒的大门外最终没能破门而入的石野良纯确实有点“倒霉”。但他同样找到了自己的宝藏，并为之快乐而满足地倾注了整个科研生涯。从这个角度来说，我们相信即便有过遗憾，但他的确不曾后悔。



△实验中的石野教授，摄于2016年12月，来源：东京新闻

参考文献：
1．「ゲノム編集」技術、基礎に日本の研究九州大石野良純教授、特殊なＤＮＡ配列を発見
https://www.sankei.com/region/news/170601/rgn1706010004-n1.html
2．「ミスタークリスパー」光栄化学賞ゲノム基礎発見 石野九州大教授
https://www.nishinippon.co.jp/item/n/652154/
3．遺伝子操作「ゲノム編集」のルーツ、クリスパー
https://sangakukan.jst.go.jp/journal/journal_contents/2019/04/articles/1904-02/1904-02_article.html
4．「あのとき調べれば…」ノーベル化学賞のゲノム編集「第一発見者」の日本人研究者が漏らした言葉
https://www.tokyo-np.co.jp/article/60367

清风寡欲

CRISPR基因编辑技术大火大热，今年获得诺贝尔奖名至实归。


但也许很多人并不了解CRISPR的本来面目，CRISPR/Cas9系统其实是细菌面对病毒入侵时的免疫系统。
CRISPR/Cas9是细菌或古细菌在面对病毒入侵时出现的适应性免疫系统

病毒是如何入侵细菌的呢？
病毒入侵细菌时，通常会将自己的基因组DNA或RNA注入到细菌的细胞内。而病毒注入的这段基因会整合到细菌的基因组中。
图中我们可以看到，噬菌体吸附到细菌表面以后，通过外壳上的蛋白，打开一个通道，将内部的基因释放出来。这段基因透过细菌的细胞膜，就能够进入细菌内部。




病毒将基因注入到细菌体内

病毒的基因进入细菌细胞后，会插入到细菌的基因组内部。对细菌来说，这将是致命的。
可以想象，如果细菌的基因组中含有病毒的基因，那么，病毒可以利用细菌的营养物质，合成自己所需要的蛋白，并且进行复制，包装成更多的病毒颗粒，最终病毒将占领整个细菌的细胞。
因此，细菌绝对不能让病毒的阴谋得逞。在病毒注入基因时，细菌就要想方设法地阻止这段病毒基因，不能让病毒的基因发挥功能。
细菌如何阻止病毒基因呢？
研究发现，细菌会启动自身的适应性免疫系统，这个系统就是我们前面提到的CRISPR/Cas9系统。
病毒基因进入细菌后，细菌会迅速获取病毒基因的序列。随后，细菌会将获取的病毒序列整合到自己基因组内的一个特定位点——CRISPR位点，从而获取对病毒的抗性。
什么意思呢？
病毒想要把基因整合到细菌的基因组，而此时，细菌先发制人，先获取这段病毒基因序列，将其整合到自己想要整合的位点，掌握主动权。之后再来想办法来对付这段病毒基因。
目前已经发现了三种不同的CRISPR机制，研究最广泛的是第二类CRISPR系统。这个系统主要通过三步反应来应对外来入侵者，分别是获取（Acquisition）、表达（Expression）和干扰（Interference），如下图所示。




CRISPR/Cas系统作为细菌适应性免疫的机制

细菌的具体防御过程是怎样的呢？
1. 获取（Adaptation）
首先，细菌要获取入侵者的DNA序列（Adaptation）。
病毒的DNA进入细菌体内后，除了病毒本身会去将自己的基因整合到细菌基因组中以外，细菌会将病毒DNA切成多个短序列，这些序列称为空格（spacer）。细菌会将这些空格序列整合进基因组的cas酶后的基因序列中，并用短重复序列将这些空格间隔开来。
短重复位点和病毒的空格序列共同构成CRISPR阵列（CRISPR Array）。




CRISPR，即Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，翻译过来就是规律间隔的成簇短回文序列。而Cas，即CRISPR相关（associated）蛋白；Cas9就是CRISPR相关蛋白9。Cas9是一个核酶，能够切割核酸。
2. 表达（Expression）
然后，细菌要合成多条短重复序列的RNA（crNA biogenesis）。
CRISPR阵列的DNA被转录出前体RNA（Precursor），并切割成为成熟的CRISPR RNA（crRNA）。Cas9基因也被转录出来并合成蛋白质。
3. 干扰（Interference）
最后，细菌需要干扰病毒基因的合成（Targeting）。
crRNA会指导Cas9到达基因组上与其同源的位置，即病毒基因的位置。Cas执行切割基因的功能，从而破坏病毒基因，达到细菌抗病毒的目的。




CRISPR/Cas9在细菌免疫中的步骤

由于细菌具有这种防御机制，即使病毒的基因插入到基因组内，也会被Cas9破坏掉功能。因此，细菌就能够抵制病毒，保护自己。
在上面这个系统中，最后一步发挥效应阶段的机制是具有重大意义的。这种意义甚至可以帮助人们破解上帝造物的密码，成为对密码进行改造、加工甚至创造新密码的基础。
最后一步短小的crRNA可以像向导一样，带领效应酶Cas到达基因组的特定位点，进行DNA切割。
它不仅能够切割病毒的基因，还能够被设计成编辑哺乳动物基因组的工具。
我们知道，哺乳动物包括人类的基因组从受精卵开始就是确定的了。尽管染色体基因组是父母赐予我们的，但这更像是上帝造人时随意编造的密码，人类一直处于接受这个密码的状态，没有方法去改变。
而就是这样一个最简单的细菌防御机制——CRISPR/Cas9系统，就打开了编辑基因的大门，让人类能够有方法去像上帝一样编造密码。
当然，使用基因编辑工具对人类基因组进行改造仍有伦理问题，人类不能随意去充当上帝的角色。
CRISPR/Cas系统分类

实际上，CRISPR/Cas系统的效应酶并不止Cas9一个，而是有很多类型的Cas酶。
根据最后切割基因的效应酶是多个Cas还是单个Cas，CRISPR/Cas系统可以分为两个大类。多个Cas发挥作用的是第一大类，单个Cas发挥作用的是第二大类。
两个大类中包括目前已知的CRISPR/Cas共包括6个类型：I型到VI型。其中第一大类包括I型、III型和IV型；第二类包括II型、V型和VI型。




第一大类和第二大类CRISPR/Cas系统

目前应用最广泛的Cas9就属于第二大类中的II型CRISPR系统。
由于第二类CRISPR/Cas系统仅使用单个效应酶，因此应用简单，科学家对其研究也最多。这一类系统中的三个类型，对应的效应酶分别为II型对应Cas9；V型对应Cas12；VI型对应Cas13。




与传统的基因编辑工具相比，CRISPR/Cas9系统作为基因编辑工具，更加简单，也更具可操作性。
这个工具的开发来源于对细菌中防御机制的发现。科学家们对CRISPR/Cas系统的改造使得哺乳动物的基因编辑成为可能。
目前仍有很多新的Cas酶被持续发现，越来越多的工具开发使得人类对于基因编辑更加熟练。基因编辑工具的前景广阔，有望能够应用到肿瘤、神经退行性病变等各种疾病的治疗中，为人类的健康贡献力量。
我们来看一看实验室里的科学家是如何利用CRISPR/cas9系统实现基因的敲入和敲除的。
CRISPR/Cas9敲除技术

CRISPR，即Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，翻译过来就是规律间隔的成簇短回文序列。而Cas，即CRISPR相关（associated）蛋白；Cas9就是CRISPR相关蛋白9。Cas9是一个核酶，能够切割核酸。CRISPR/Cas9技术也被称为基因的“魔剪”。




作为一个切割DNA的酶，Cas9是如何确定去切割DNA上的哪个基因呢？
这就需要向导RNA（guide RNA），也叫gRNA。gRNA是一段单链的RNA序列，可以指导Cas9到达切割的位点。
首先，gRNA是一段和基因上特定序列互补的一段单链RNA序列，大小约20bp。Ca9能够和gRNA结合在一起，而gRNA能够锚定到特定的基因序列上。因此，gRNA带领Cas9这个酶来到特定的切割位点，切开基因。Cas9像一把剪刀，能够使DNA双链断裂。






当基因发生双链断裂时，细胞需要对断裂的基因进行及时修复，否则，基因双链断裂对细胞来说通常是致命的，会引起细胞凋亡。
细胞如何修复断开的基因呢？通常有两种主要的方式：非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）和同源重组修复（Homologous Directed Repair，HDR）。通过DNA修复，断裂的基因能够重新连接起来。

• 非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）
  

NHEJ是一种快速非精确的DNA修复方式。当基因组发生断裂时，细胞可以通过在断裂位点增加或减少几个碱基，快速将断裂的基因连接起来。由于在修复过程中，基因的碱基发生了变化，减少一个或多个碱基，因此基因的序列就发生了变化。产生突变的基因无法正常表达出蛋白质，就失去了功能。

• 同源重组修复（Homologous Directed Repair，HDR）
  

同源重组修复方式需要一段同源序列作为模板。例如，当一条染色体发生断裂时，同源染色体上相应的片段可以作为同源序列，使断裂的基因重新合成。这种修复方式是精确的，一般不会改变基因的序列。
当两条染色体同时发生断裂时，细胞没有内源的同源染色体作为模板，就无法进行同源重组修复。此时，非精确的NHEJ是主要的修复方式。如果细胞内没有这种快速的修复方式，那么基因组断裂对于细胞来说就是致命的，修复不好细胞就会走向凋亡。
NHEJ修复方式会产生突变，产生的突变对物种的进化有一定的贡献。
通常情况下，NHEJ的修复方式效率更高，更快，但是不精确，会引起基因序列的变化，影响基因功能。相反，HDR的修复方式效率较低，速度较慢，并且需要另一条染色体上的同源序列，但是非常精确，不造成基因序列的变化，基因功能不变。




当gRNA像向导一样带领Cas9来到特定的基因上以后，Cas9切割DNA造成双链断裂，随后，细胞通过内部的修复方式，将断裂的DNA重新连接起来。
从细胞群体来看，有的细胞会发生NHEJ修复，有的细胞会发生同源重组修复。这时，科学家就需要挑选那些发生了NHEJ修复，基因发生突变的细胞。
那些使用同源重组修复方式修复DNA断裂口的细胞，基因没有突变，也就没被敲除，这种细胞就不能要。
当科学家们通过筛选得到那些失去特定基因的细胞时，就完成了一个基因敲除的过程。
然而，想要敲入基因时，HDR修复方式的细胞则会成为科学家们想要的细胞。
CRISPR/Cas9敲入技术

当科学家需要基因敲入时，就必须提供一个外源片段，充当同源重组修复的同源系列。待敲入的目标基因便藏于这一外源片段中。
Cas9酶在gRNA的引导下，切割目标DNA。随后，DNA修复发生。
当细胞利用同源重组修复方式，以此片段为模板，在断裂处合成与同源序列互补的基因序列，这样就实现了基因敲入的目的。




同样，细胞群体里仍然会有一部分利用NHEJ修复断裂的DNA链，这些细胞没有实现基因敲入，需要筛选掉。

CRISPR/Cas9介导的基因敲除和敲入，高效、精确、价格低廉，是最热门的基因编辑技术。除了在DNA上编辑，CRISPR/Cas系统还可以在mRNA上操作，实现基因的敲减，即不影响DNA，只降解mRNA，从而实现功能蛋白的表达量降低。

长长的路

为了庆祝我的毒奶成功，我来更新一发：
看到好多同学都在科普基因编辑和CRISPR技术，朋友圈难得的刷屏了，生理学奖发布的时候都没有刷屏。
我这里给大家说一点张峰和姐妹花的专利争斗和CRISPR技术科普以外的故事吧。
我大概是17，18年上手的CRISPR，但其实基因编辑技术很早就有了，比如ZFN（zinc-finger nucleases锌指核酸内切酶）和TALEN（transcription activator-like effector nucleases类转录激活因子效应物核酸酶）技术。
这两个名字跟CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats规律成簇的间隔短回文重复）一看就不一样，也说明了CRISPR的不同。
这三种技术的根本区别在于，打个比方，前2个技术是我们用零件组装的设备来完成工作，而CRISPR是找了一个代理人来完成。相当于我们借用了一个生物自有的生理功能来进行基因编辑，而不是人工搞了一个什么奇怪的东西进去。
那么为什么ZFN什么的没火起来，而CRISPR就突然火了呢？
核心原因并不是这技术多先进，或者多精准，在某些体系你CRISPR反而还不如ZFN和TALEN好用。那么核心原因是什么呢？
便宜！
真的，别笑，就是便宜。大家知道搞科研是要钱的，没有科研经费你点子再好，思路在多，都白扯。
CRISPR的易用性都不是最重要的，科研人员不怕麻烦，但是一分钱难倒英雄汉这句话在任何场合都试用，而CRISPR就成了哪个廉价而且还比较好用的选择，传说中的性价比机皇。
我给大家粗略的解释下基因组学的同学们搞研究的一个方法，就是破坏法。
比如我现在有一辆车，我知道这个车给油就走，但是它是怎么走的，什么地方起到什么作用并不清楚，那么要怎么研究呢？
我先把这个车的图纸（基因组）上关于车灯地方（基因）给戳（敲除）了，然后在来看车辆运行情况。咦，这灯不亮了嘿，那么我刚才戳的那里就是车灯的图纸唄。
没错，生命科学就是这么个思路，跟物理学组装收音机正好是相反的，我们面临的情况是收音机已经有了，你要逆推图纸和电路原理出来。
回想一下以前做基因编辑的时候，都要谨慎设计思路，大量的查阅文献，反复理论论证，然后战战兢兢的跟老板说，我想试下某某基因的敲除，可能会有什么什么效果，您看行不？
现在有了CRISPR以后呢？老板上来大笔一挥，某某，来来，先把这些xx，xxx，xxxx基因都敲一遍观察下效果，然后论证下这些基因在某些癌变或者什么功能中可能起到的作用。
听听，豪气不？上一次能让生物学家这么豪气的事情是新一代高通量测序技术的普及。以前测一个人类基因组要几十亿美金，现在呢？恨不得养个菌都去送测下看看质粒转录的怎么样。
所以基因编辑技术极大的提高了整个生命科学的科研进度。给了科研工作者一个又便宜又好用的研究基因的工具。
至于很多人担心的什么基因编辑婴儿啊，人类改造啊什么的其实这并不是CRISPR需要担心的事情，即便没有CRISPR，人们用ZFN什么的也能赶出来这事，只是成本更高，这一天到来的更晚而已。还是把这些事情留给生命伦理学家去讨论吧，我们就用好这个技术就行了
顺便吐槽一下，啥时候高通量测序能拿诺奖哎。

<hr/>本来这是个化学奖跟我关系不大…
但是我这口毒奶啊…


当时毒奶的是生理学，然后同学们的评论集中在，是会拿医学还是化学，另一个就是给不给张峰…
没想到啊没想到，2个都被严重了，果然知乎评论区都是大神…
<hr/>

卡卡

北京时间今天下午，诺贝尔基金会宣布，近年来火热的CRISPR基因编辑系统斩获本年度的诺贝尔化学奖，在这一领域做出卓越贡献的Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授摘得桂冠。正如人们所说的那样，这一革命性的发现为整个生物技术领域提供了无限可能。




▲今年的诺贝尔化学奖得主（图片来源：参考资料[1]）

地中海边的神奇发现


CRISPR基因编辑系统的故事还要从一座名为圣波拉（Santa Pola）的地中海小城说起。30年前，一位名为Francisco Mojica的年轻人在当地的一所大学开始攻读博士学位，而他的研究对象，就是圣波拉海滩上发现的一种古细菌。




▲CRISPR基因编辑的诞生，离不开Francisco Mojica教授的发现（图片来源：BBVA Foundation）

在分析这种古细菌的DNA序列时，年轻的Mojica观察到了一个有趣的现象——这些微生物的基因组里，存在许多奇怪的“回文”片段。这些片段长30个碱基，而且会不断重复。在两段重复之间，则是长约36个碱基的间隔。对于这种具有规律性的重复，Mojica后来给它起了一个拗口的名字“常间回文重复序列簇集”（ClusteredRegularlyInter-SpacedPalindromicRepeats）。不过它的缩写好记多了，它就是本文的主角CRISPR。

事实上，这并不是人类首次发现CRISPR序列。早在1987年，一支日本团队（石野良纯教授为第一作者）就已发表论文，表明大肠杆菌里也有类似的序列。不少科学家认为，这是人类首次知道CRISPR序列的存在。然而，这支日本团队当时并没有对CRISPR序列进行详细的研究，因此它的功能还不为人所知晓。




▲1987年的这篇论文，可能是人类首次知道CRISPR序列的存在（图片来源：参考资料[3]）

Mojica教授推断说，如果两种有着巨大差异的微生物里都有这种奇怪的序列，这就说明它肯定有着某种特殊的功能。在成立了自己的实验室后，他又发现大约另外20多种微生物里，同样具有CRISPR序列。然而，这种奇怪序列的功能，却迟迟未能得到解答。
微生物的“免疫系统”


为了寻找CRISPR序列的功能，Mojica教授每天都在数据库里痛苦地搜索，想要发现这些奇怪序列的意义。2003年，大海捞针般的探索，还真的给他找到了一片新天地！Mojica教授发现，一些大肠杆菌内的CRISPR序列，与一种叫做“P1噬菌体”的病毒的序列高度吻合。顾名思义，噬菌体是一种能够“吃掉”细菌的病毒，这一种噬菌体也的确能够攻击大肠杆菌。但有意思的是，Mojica教授所研究的这批大肠杆菌，竟能完全不受P1噬菌体的感染！

Mojica教授立刻意识到，这与人类的免疫系统何其相似！在人体里，免疫系统会记住过去遇到过的病原体的模样。等到病原体入侵时，就会对其发起攻击。而在大肠杆菌细胞内，CRISPR序列也同样能让细菌记住噬菌体的模样，抵抗病毒的感染。




▲一种微生物体内的CRISPR系统的工作原理（图片来源：参考资料[2]）

为了这一刻，Mojica教授已经等待了18个月的漫长时光。兴奋的他在2003年向《自然》杂志投去了他的研究结果。很快，《自然》的编辑以“早就知道了”为由，拒绝发表这项研究。不久后，《美国国家科学院院报》（PNAS）也以“缺乏新颖性和重要性”，同样予以拒绝。再之后，Molecular Microbiology与Nucleic Acid Research两本期刊也给Mojica教授发了拒信。万念俱灰之下，他把论文投给了Journal of Molecular Evolution，一本影响因子不到2分的期刊。即便如此，这篇论文还是经过了长达一年的修改和审核，才最终得以发表。此时，已是2005年2月。
切开DNA的魔剪


在接下来的几年里，科学家们对CRISPR序列的作用做了进一步的完善，并阐明了它的详细机理。原来在病毒感染细菌后，CRISPR序列会喊来帮手，形成一个具有核酸切割能力的复杂结构，并最终切断病毒的DNA。对于细菌来说，这是从源头清除病毒感染的好方法。

但对生物学家来说，这套细菌的“免疫系统”，让他们看到了精准切割DNA的希望！或许，它能被开发成为一种高效的基因编辑方法。2012年，维也纳的Emmanuelle Charpentier教授与加州大学伯克利分校（UC Berkeley）的Jennifer Doudna教授在《科学》杂志上发表了她们的发现，确认她们所设计的CRISPR-Cas9基因编辑系统（Cas9是一种能切割DNA的内切酶）能在DNA的特定部位“定点”切开口子。在论文中，她们也指出将来有潜力利用这个系统，对基因组进行编辑。




▲Emmanuelle Charpentier教授与Jennifer Doudna教授报道的CRISPR基因编辑系统（图片来源：参考资料[4]）

这里还有一个小插曲。在立陶宛，一名叫做Virginijus Siksnys的科学家也在研究使用CRISPR系统编辑基因的潜力。虽然他的论文投出的时间更早，但不幸被《细胞》杂志的编辑所拒，只能转投《美国国家科学院院报》。这也使得他的论文最终要晚上2个月上线。




▲张锋教授团队也报道了CRISPR基因编辑系统的重要应用（图片来源：参考资料[5]）

2013年新年伊始，《科学》杂志再度刊登了一篇关于CRISPR系统的重磅文章。这一次，主导这项研究的是Broad研究所的张锋教授。论文里，科学家们首次将CRISPR技术应用到了哺乳动物细胞内，并证明它能在短短几周之内，就建立起小鼠的疾病模型。随后，这支团队也首次在人类细胞中成功使用CRISPR-Cas系统完成了基因编辑。
发展与争议


自CRISPR-Cas9基因编辑技术诞生以来，科学家们对其进行了大量的优化与改造。一方面，现在的CRISPR基因编辑技术可以变得更精准，带来更少的脱靶效应（指修改了不应修改的基因）；另一方面，CRISPR系统也已经超越了DNA，能够对RNA进行有效编辑。

此外，初代的CRISPR技术涉及DNA双链的断裂，会引起潜在的风险。如今，科学家们基于CRISPR体系，已经开发出了“单碱基”基因编辑系统，能够对基因进行“微调”。如果说以前的基因编辑，是把书的一页纸撕下，再粘上一页新的纸的话，这种“单碱基”基因编辑系统，就好像是把书页上的错别字给单独修改，有着更高的精度。




▲和CRISPR或Cas9有关的论文数近年来呈指数上升（图片来源：参考资料[7]）

当然，围绕着CRISPR的争议也不少。自这项技术问世以来，有关CRISPR基因编辑技术的专利就一直是个热议的问题，迄今也没有得到完美解决。此外，人们虽然确信CRISPR基因编辑技术迟早会得诺奖，但哪几位科学家能最终获奖，不同的人也会有不同的看法。

我们在这里也强调，随着时代的发展，当今科学的突破性进步，往往不再依赖一两名科学家的“尤里卡时刻”，而是要靠群体智慧的多年合作。我们祝贺今日斩获诺奖的这两名科学家，也同样感谢其他辛勤工作的科研人员们。没有所有参与者的加入，CRISPR基因编辑技术势必难以得到如此迅猛的发展。在这里，我们也向这些科学家们致以崇高敬意！

参考资料：
[1] The Nobel Prize in Chemistry 2020, Retrieved October 7, 2020, from https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/
[2] Eric S. Lander, (2016), The Heroes of CRISPR, Cell, DOI: 10.1016/j.cell.2015.12.041
[3] Yoshizumi Ishino et al., (1987), Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product, Journal of Bacteriology, DOI: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987
[4] Martin Jinek et al., (2012), A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity, Science, DOI: 10.1126/science.1225829
[5] Le Cong et al., (2013), Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems, Science, DOI: 10.1126/science.1231143
[6] The BBVA Foundation distinguishes Emmanuelle Charpentier, Jennifer Doudna and Francisco Mojica, instigators of the CRISPR "revolution" in genome editing, Retrieved October 7, 2019, from https://www.prnewswire.com/news-releases/the-bbva-foundation-distinguishes-emmanuelle-charpentier-jennifer-doudna-and-francisco-mojica-instigators-of-the-crispr-revolution-in-genome-editing-300399728.html
[7] Mazhar Adli (2018), The CRISPR tool kit for genome editing and beyond, Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-018-04252-2
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清风寡欲

2020年诺贝尔化学奖揭晓
北京时间10月7日晚，2020年诺贝尔化学奖颁给了2020年诺贝尔化学奖已授予Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna.
表彰其在「用于开发基因组编辑方法」的工作（就是CRISPR啦）
获奖人简介
Emmanuelle Charpentier



Emmanuelle Charpentier博士，法籍微生物学家，现为德国马克斯·普朗克研究所感染生物学研究所所长。在CRISPR的发展中，其主要的贡献在于发现Cas9蛋白的活性仰赖tracrRNA。
Jennifer A. Doudna


Jennifer A. Doudna博士，为伯克利大学化学和分子生物学与细胞生物学教授，霍华德休斯医学研究所的研究员，美国国家科学院院士。她与Emmanuelle Charpentier博士共同发现Cas9 的切割作用和，crRNA 的定位作用，并将crRNA与tracrRNA可以融合成单链引导RNA（sgRNA）。
。。。
CRISPR已经是目前生物医学方面非常普及的的基因编辑技术，近几年该技术的飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。

1. 什么是CRISPR
CRISPR的全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，中文翻译为“规律成簇的间隔短回文重复”。这个词的字面意思就是“代表了同一类特征明显、排列整齐、秩序一致的重复序列”。它作为细菌的适应性免疫系统，当外源病毒或质粒DNA进入细胞时，专门的Cas蛋白会将外源DNA剪成小片段，并将它们粘贴到自身的DNA片段中存储。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存储的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效(1)。
科学家利用CRISPR的这一功能，将其改造成为一种革命性的新型分子工具。由于它具有精准的定位和切割任何种类的遗传物质的能力，使得科学家能够更得心应手地破解地球上任何生物(包括人类)的生命密码。
2. CRISPR 简史



图1：CRISPR发展简史


CRISPR的发现与命名
早在1987年，日本大阪大学的Nakata研究组在分析大肠杆菌时就发现，细菌中存在一些异常重复的序列（2）。但当时人们并不知道这些重复序列究竟有什么作用，甚至还没有正式为这些重复序列命名。直到20世纪80年代末，西班牙阿利坎特大学的Francisco Mojica再次在一种古菌种发现了类似的重复序列（3），这引起了他极大的兴趣。在随后的研究中，他一直在微生物中寻找类似结构，到2000年他已经在20多种不同的微生物种中发现了这一类似的序列（4）。2002年，荷兰乌得勒支大学的Ruud Jansen发现不同物种的重复序列碱基数存在巨大差异，并且这种序列仅存在于原核生物中。为了更好地规范相关的研究，他们共同为这种重复序列命名为“CRISPR”。。多个CRISPR相关基因则被命名为Cas（CRISPR-associated）家族（5）。


CRISPR-CAS系统的生物学作用
    2005年，CRISPR研究迎来了一个重要发现，两个研究小组（Mojica和Pourcel）都观察到了CRISPR重复序列之间的间隔序列并非来自于原核生物自身，而是来源于质粒或病毒（6，7）。因此，Mojica提出CRISPR是一种适应性免疫系统的假设。同年，Bolotin研究组在嗜热链球菌中发现了Cas9，并预测这个庞大的蛋白质具有核酸酶活性。他们还发现与病毒同源的间隔序列都具有一种类似的尾巴，称为PAM（protospacer adjacent motif）序列，它们对靶序列的识别至关重要。
受到这一假说的激发，当时还在著名的酸奶公司Danisco工作的法国微生物学家Rodolphe Barragou决定对其进行验证，以解决嗜热链球菌爆发噬菌体感染死亡而影响酸奶生产的问题。2007年，他们通过实验证明CRISPR系统确实是一种适应性免疫系统。嗜热链球菌被病毒入侵后，整合了来自噬菌体基因组新的间隔序列，同样的病毒再次入侵时细菌就有了抵抗攻击能力（8）而Cas9蛋白可能是产生这种免疫能力所必需的。这是首次在实验上证实了CRISPR-Cas是一种细菌获得性免疫系统。


CRISPR-CAS的作用机制证实
CRISPR-CAS生物学功能的证实，使得许多研究团队认识到这一系统的重要性，随后许多研究团队纷纷开始补充CRISPR-Cas系统干扰噬菌体机制的细节。2008年，John van der Oost研究小组在大肠杆菌中发现，来自噬菌体的间隔序列被转录成小RNA，成为CRISPR RNA（crRNA），并引导Cas蛋白到靶DNA上。Marraffini和Sontheimer在同年证明了CRISPR-Cas系统的目标分子是DNA，而不是RNA。他们还明确指出，如果将该系统转移到非细菌系统中，可能成为一种强大的工具系统（9，10）。这为随后的基因编辑埋下了伏笔。
2010年12月，Moineau团队证明了CRISRP-Cas9在PAM序列上游位置的精确切割使DNA双链断裂。而作为II型CRISPR系统的显著特征，Cas9是切割唯一需要的蛋白，它与crRNAs共同介导CRISPR-Cas9的干扰功能（11）。
2011年，Charpentier研究组对酿脓链球菌进行了小RNA测序，发现除了crRNA以外，还存在一种小RNA，称为式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。tracrRNA通过24个核苷酸与crRNA中的重复序列互补配对与形成双链，引导Cas9到靶DNA。至此，天然CRISPR-Cas9干扰机制的拼图基本拼搭完整（12）。


CRISPR-CAS基因编辑技术的出现
2012年Charpentier和Doudna团队合作，不仅证明Cas9具有切割DNA双链的能力，还能够将tracrRNA和crRNA链接成sgRNA（single guide RNA），并在体外实验中证实了sgRNA也可以指导Cas9蛋白完成对DNA的双链剪切。他们可以通过改变crRNA的序列控制Cas9的靶向位点（13）。随后Siksnys团队也报告了相同的发现。这一发现不仅是细菌获得性免疫系统领域的里程碑，更开启了CRISPR-CAS基因编辑技术的新篇章。很快，2013年初的多篇论文都将CRISPR-Cas系统成功地应用到了哺乳动物细胞中。其中，Church研究组设计了II型CRISPR-Cas系统，在人293T细胞、K562细胞以及诱导多能干细胞中通过设计sgRNA成功靶向特定序列，且多个gRNA可以实现对目标基因的多重编辑（15）。张锋实验室证明了CRISPR-Cas9系统可以在人类和小鼠细胞中进行精确的定点切割，并且将Cas9突变为缺口酶，促进同源修复过程（14）。Qi研究组则建立了CRISPRi系统，还实现了多sgRNAs 靶向多基因(Tet1、Tet2、Tet3、Sry 和Uty)的同时定点突变（16）。Wu等人利用CRISPR-Cas9系统对Crygc 显性突变的小鼠进行基因治疗使其获得了健康的后代，为CRISPR-Cas9 系统用于遗传疾病的基因治疗提供了依据（17）。
由此，CRISPR系统在多种生物的基因定点编辑、基因组筛选、基因转录调控、基因组成像、基因诊疗、生态应用等领域的研究与应用开始井喷。随后几年，张锋实验室更将CRISPR-CAS的基因编辑系统进行了拓展，不仅发现了在特异性和多基因编辑方面都有着很大优势的CRISPR-Cas系统：CRISPR-Cpf1（18），还发现具有RNA酶功能的CRISPR酶Cas13a（C2c2）（19）和Cas13b（20）。2017年，有多篇文章研究了CRISPR-Cas13系统的作用机制、在临床诊断中的应用以及在哺乳动物细胞靶向RNA的能力。


3. CRISPR 基因编辑技术的应用
CRISPR技术迅速发展使得它在转化医学和疾病治疗领域中的应用不断创造出惊喜。2015年Science杂志发表了成功使用CRISPR治疗遗传性疾病动物模型的方法。他们利用CRISPR系统编辑Dystrophin基因，能够不同程度修复杜氏肌营养不良症小鼠的肌肉功能，从而达到治疗DMD的效果（21）。2018年有研究证实利用CRISPR技术成功治疗了四只患有DMD（Duchenne型肌营养不良症）的狗，并将其肌肉和心脏组织中的营养不良蛋白恢复到正常水平的92%（22）。此外，CRISPR技术还与细胞免疫疗法相结合以完善CAR-T疗法，并在小鼠中增强了肿瘤抑制作用。首次利用CRISPR-Cas9在T细胞中敲除PD-1基因的临床试验已被批准用于治疗肌肉浸润性膀胱癌、去势抵抗性前列腺癌、转移性肾癌和转移性非小细胞肺癌，并在2016年开始了I期临床试验（23）。


4. CRISPR的其他应用
目前，CRISPR 并不止在基因组编辑得到了应用，在基因检测方面也展现了巨大的潜力。在2017年《Science》发表的研究中，Doudna 团队发现了一个很有趣的现象：CRISPR 系统在剪切靶向的双链 DNA 的同时，Cas12 的 DNA 酶活性会被激活（24）。这个发现为检测细胞内是否含有某目的DNA 提供了一个全新的思路：同时向细胞内递送靶向该 DNA 的 CRISPR-Cas12a 系统和非特异性 ssDNA 荧光报告基因（FQ-labeled reporter），一旦检测到目的 DNA，CRISPR-Cas12a 系统将启动，与此同时，荧光报告基因也会被降解，从而释放出荧光信号。利用这一技术，Doudna 团队开发了DETECTR系统，能够在一小时内100%准确检测出 HPV 16 感染，且单次测试成本不到一美元。与此同时，张锋团队也利用CRISPR-Cas13a开发出了SHERLOCK系统和SHERLOCKv2系统（25），与Doudna团队不同，张锋团队设计的荧光报告基因必须是特异性，也正是“特异性”这个优点使得 SHERLOCKv2 可以同时检测多种序列。张锋团队还开发了类似验孕棒的试纸检测方法，只需一张试纸，SHERLOCKv2 就能显示出病毒感染的检测结果，这使得检测更为便利。在今年COVID-19的检测技术开发中，SHERLOCKv2也曾一显身手。
虽然目前 DETECTR 和 SHERLOCK 已向我们展现出它们在诊断中的强大力量，但是在进入临床使用前，为了确保诊断的准确性，研究者们仍然需要做大量的工作。我们相信这些新的诊断工具必将改写未来的诊断技术，尤其是为那些卫生条件相对较差、病毒高发的发展中国家在病毒感染诊断上带来巨大的帮助。

参考文献：
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