我已经做了三次western blot我根本没看到任何目标条带，我现在很绝望，我该怎么办？

虎威将军

我是一名生物科学的本科生，我在研究IL-18在被IL-β刺激的SW1353细胞中是上调还是下调。所以选用了western blot在做。
我在文献和公司给的IL-18  antibody说明书中看到了the molecular weight of pro-IL-18 is 24 kDa, the  activated il-18 is 17 kDa.我用的是10%的分离胶和5%的浓缩胶跑的western  blot，内参是actin.。但我已经做了三次western  blot我根本没看到24或者17左右的任何条带，只看到了actin和其它杂带。由于我的supervisor是个英国人，实验基本靠我自己设计，我就很迷茫，也不知道该怎么办现在。
我一个是怀疑我的抗体，一个是怀疑是否有蛋白出现。我是用T25 flask培养的细胞。每次都是收割细胞后提取蛋白。蛋白浓度这几次都在5-8μg/μl,左右。我用的1.0mm的加样，每孔加样50μg
再就是怀疑是不是IL-18前体被切割后，大部分释放到了培养基中，我能否用培养基来做western blot呢？

原文地址：https://www.zhihu.com/question/434949724

感恩由您

本文转自公众号ProteintechGroup
WB又出现杂带，你考虑过这个环节吗？做WB的小伙伴们都知道,样品制备是非常重要的一个环节。
有效的样品制备不仅能让咱们事半功倍，节省实验时间；同时它还会影响WB实验结果的准确性，以及实验的可重复性。
那么究竟什么样的蛋白样品才是成功有效的呢？
有人说：能测出阳性条带的样品！（没毛病，非常正确！）
那测出来的条带有杂带呢？
那一定是抗体的锅，反手就是一个投诉！（抗体表示有些委屈~）
其实，在WB检测过程中出现非特异性条带，除了一抗因素，样品也可能是那个罪魁祸首！
样品制备环节的哪些因素会带来杂带呢？小P带大家梳理一下~
1.细胞污染


解析：
细胞样品的交叉污染、分化和传代次数过多，都会使蛋白的表达谱发生变化而出现杂带。Vimentin在MCF-7中本不表达，但由于以上原因导致Vimentin抗体能在MCF-7细胞中检测到条带（杂带）。
对策：
1）确保细胞来源，最好有STR鉴定；
2）规范细胞传代的各个步骤，避免细胞的交叉污染；
3）严格控制传代次数，20代以内的细胞制样最佳。
2.胰蛋白酶剪切


解析：
样品制备时，我们一般会使用胰蛋白酶消化一下细胞，此时有一些目的蛋白会被剪切成短片段，而这些短片段通常会被识别，从而出现“杂带”。
对策：
针对该类样本，不要使用蛋白酶消化，可以改用刮刀收集或直接加裂解液到细胞皿或细胞瓶中直接裂解。
3.血液及血液制品干扰


解析：
血液里的IgG被二抗识别而出现杂带。IgG的重链和轻链在电泳过程中分离，且刚好该IgG与一抗同源，均被二抗识别而出现杂带；一般重链条带在55kDa左右，轻链在25kDa左右。
对策：
细胞和组织样品，尤其是对于血含量多的组织（如：心、肝、脾、肾等），在裂解前需要充分的清洗，以完全去除血液和血清残留。
4.还原不彻底


解析：
蛋白样品由于加的还原剂量不足或没加而导致蛋白还原不彻底，以二聚体或多聚体存在，形成分子量更大的杂带。
对策：
1）样品制备时添加足量的还原剂，推荐1X Loading Buffer至少加5% BME或100mM DTT；
2）-20℃或-80℃分装保存的样品在存放半年后，补加还原剂并100℃煮样5分钟后再使用。
5.内源蛋白酶剪切


解析：
样品在制样过程中，除去人为添加的胰蛋白酶，内源的蛋白酶也会被释放到裂解液中，靶标蛋白会在一定的程度上被降解、碎片化，形成片段更小的杂带。
对策：
1）提取过程全程保持低温，降低蛋白酶活性；
2）裂解液中加入高质量的蛋白酶抑制剂；
3）对于组织样品，尽量取新鲜的样品制备，制备方法选用液氮研磨的方法，将样品降解可能降到最低；
4）样品制备好后及时使用，如需保存可分装成数管保存在-20℃或-80℃冰箱，避免反复冻融。
6.裂解不充分


解析：
由于样本制备过程中裂解液加入量过少，导致样品裂解不充分，凝胶孔中有大颗粒残留。
对策：
样品裂解时需要加充足的裂解液，推荐裂解液与细胞体积比至少为3:1，不同组织和细胞之间需要调整。裂解完成后样品浓度保持在3-6ug/ul比较理想。
7.样品粘度大


解析：
样品没有超声或超声不彻底导致核酸未被打断成小片段，从而导致样品粘度高，WB结果出现拖尾等杂带。
对策：
1）样品制备过程中对样品进行超声波处理（推荐1ml的样品使用200W超声2分钟），彻底的将核酸打断。
2）存放一段时间的样品如果出现粘稠，在使用前用超声波处理直至不再粘稠。
8.上样量过多


解析：
在WB实验中，样品上样量过多，由于部分蛋白与抗体的非特异性结合增加，也会导致杂带的出现。
对策：
实验时可以做一个样本浓度梯度上样，根据靶标抗体的表达情况选择合适的上样量。

“道理都懂，状况频出”。理想和现实之间总是有些差距，稍微有一点细节没注意就有可能中招。所以小伙伴们在制样时一定要多注意细节，避免上述问题。
以下是Proteintech公司资深样品制备实验员为大家总结的样品制备关键细节清单，希望对你们有帮助：
1）样本制备的所有步骤必须低温下进行（冷血动物样品除外），所有试剂都需提前预冷。
2）细胞来源可靠（有STR鉴定），传代次数不要过多，20代以内的细胞制样最佳。
3）收集细胞不建议使用胰蛋白酶消化，可以选择在培养瓶或培养皿内直接裂解或用细胞刮收集细胞后再裂解。
4）对于组织样品，尽量取新鲜的样品制备。尤其是消化系统相关的组织，制备推荐选用液氮研磨的方法，在不影响提取效果的前提下，可以考虑高浓度SDS等强烈的裂解液以缩短裂解时间。
5）使用预冷的PBS洗净细胞及组织中的外源蛋白和脂类，尤其是细胞培养液中的牛血清和组织块中的血液。对于血含量多的组织（如：心、肝、脾、肾等）可以使用200目的网筛将其磨成单个细胞后再清洗，清洗的PBS中需加入适量的蛋白酶抑制剂。
6）样品制备过程中需加入蛋白酶抑制剂，针对蛋白含量高或容易降解的细胞或组织可以加倍使用。用于磷酸化靶标抗体的检测还需加入磷酸酶抑制剂。
7）加入足量的裂解液不仅可以得到更多的可溶性蛋白，而且可以降低蛋白质的聚集和黏度。推荐裂解液与细胞体积比至少为3:1，不同组织和细胞之间需要调整。裂解完成后样品浓度保持在3-6ug/ul比较理想。
8）超声破碎这一步十分重要，尤其对于核蛋白的提取极有帮助。通过超声波可以将核酸打断成小片段，从而使其不能形成完整的蛋白质结合结构域而最终与蛋白分开。
9）还原剂需现用现加，量要加足,推荐每1X的蛋白上样缓冲液（1X loading buffer）中至少加5%BME或100mM DTT。存放半年以上的样品需补加还原剂煮样后再使用。
10）蛋白样品提取完成后，建议用BCA法准确测定浓度，并将样品的蛋白浓度和盐离子浓度调到一致，以确保上样量清楚可控。
11）样品最好现制现用，如需保存，可分装成数管保存在-20℃或-80℃冰箱，避免反复冻融。保存半年以上的样品，推荐在使用前补加还原剂沸水煮样后再使用。

清风寡欲

il18是分泌型蛋白，看看抗体说明书别人的示意图里结果是怎么做的，问问自己：你的细胞是否能分泌il18；由于western取样是确定的时间点，你需要确定il18转录翻译最多的时间点进行检测（时间依赖性分泌情况），切忌把其当做普通蛋白在长时间处理后检测；其次是否需要加入高尔基体抑制剂等抑制蛋白分泌的东西（可以找一个确定分泌18的细胞系做阳标确定抗体是否好用）。20kd蛋白很小，建议12-15%分离胶（浓缩胶浓度影响不大）。如果只是看这个细胞因子表达改变可以用pcr简单检测一下再辅以elisa检测，个人认为western对于这类分泌型蛋白检测结果参考意义不大。抗体浓度需要测验一下，不要迷信说明书，可以参考！
希望有用。
供参考：
一个做了10年基础研究菜鸟的一点儿心得，希望对喜爱科研又受困于不能做出漂亮结果的菜鸟们有用。
首先，希望我直接给出试剂配制加多少毫升/微克组分，电泳、转膜多大电流电压跑多久的同学请绕道，因为我跑不同的蛋白都会调试相应条件，这是想做好Western的前提--不能死记硬背，墨守陈规！
下面是干货：
1、蛋白样准备。
细胞组织裂解有条件一定要加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及PMSF，保证蛋白的完整。β巯基乙醇一定要加，尤其是有很多亚基的蛋白，只有把亚基间的二硫键破坏，才能得到你的抗体所检测的蛋白多肽。
有条件一定要测定蛋白浓度，不要迷信于基于细胞计数+调内参的Western，事实是在特定处理下，内参的表达也会发生改变（例如PDGF-bb处理就会改变actin）。在这种情况下，只有用蛋白浓度计算得到的上样量才是标准上样量，才能进行横向比较。
测完浓度，计算得到相同上样量所需体积后，一定要保证最后的跑胶样品上样体积和样品中的离子浓度一样（这是你跑出相同宽度完美条带的必要条件）。我一般是蛋白样品+loading，剩余的用裂解液补齐，marker也会补相应的loading。最后总体积不要太大，＜40都是可以的。
2、配胶
玻璃板一定要洗干净，不然到时候胶不匀，跑出来波浪形的条带也不奇怪。要想蛋白分得开，浓度就大一点。如果特别着急，temed是可以多加的，有时候多加1-5都是可以的。液封用异丙醇页面比较整齐，乙醇也是可以的，液封的时候一定要慢，加的太猛会让你的液面一言难尽。上层胶一般2-3厘米左右，反正比梳子长一点就可以。
3、电泳
跑胶之前先用30V左右的小电压跑3-5分钟，让胶里面的离子和电泳液的一致（重要的样用新配的电泳液，不要省）。上样按同体积同离子浓度跑，marker也要加loading，否则最两边的样品会跑歪。
4、转膜（得到好结果的关键步骤）
一定一定要避免气泡！！！气泡主要有两个来源：（1）制作转膜三明治的时候没有赶尽气泡。滤纸和胶，胶和膜，膜和滤纸之间一定要把气泡赶尽，有气泡就会断路，断路蛋白就没法迁移到膜上。（2）从电泳液携带过来的小气泡。一般电泳过的胶不要直接放转膜液里，自来水冲洗一下，把上面的小气泡冲掉，保证开始转膜时转膜液里没有气泡。另外，一层一层放置膜和滤纸时，要先把滤纸或者膜的一边放到胶上，然后缓缓把剩下的滤纸覆盖到胶上，可以避免有气泡。
转膜液回收可以，但记得每次用回收的转膜液补一点儿甲醇，增加降温效果。
5、封闭（没啥好说的）
6、孵一抗
一抗很贵，所以尽量回收。可以用santa的含叠氮钠PBS和BSA配制成5%（m/v）的一抗稀释液，四度放置。一次可以配4-5ml，可以用2-3个月。个人感觉挺划算（ps：用这个方法博士都只用了一支抗体，还没用完）。
一抗的最佳工作浓度要自己测，别迷信说明书，自己设几个浓度梯度1：500，1：1000，1：2000，你会发现有的1：1000的抗体，其实用1：2000效果可能更好。另外，不是抗体越浓越好出条带（1：5000能出的条带，1：1000却一团黑），抗体浓度要摸！！！
7、孵二抗和曝光就没什么好说的了，基本前面的注意了，后面几乎能出出好条带。
暂时想到这么多，大家有不同意见或者更好的方法的，可以说出来大家一起讨论。
供参考。
我是小皮埃，如果想了解更多生物医学研究，请关注我的公众号BioSeminar。

检验医师

描述太少了。positive control work说明你手法没有太大问题，那么抗体有问题是有可能的，但除非用了错的抗体，一般过期几率不高，毕竟抗体非常的耐操。你查过你现在用的抗体的引用文献，看别人的效果了吗？
另外western blot最直接的问题，你signaling stimulate了多长时间？做个time course呗。万一你stimulate的时间不够，那看不见也正常。

卡卡

抗体是Santa Cruz 的吗？抗体是否能出条带跟公司的抗体好坏很有关系，有威信的大公司也不一定能够保证每种抗体都能出条带，有时候同公司同蛋白clone不同的也会有差异。你可以发个邮件问问周围实验室是否有不同公司的IL-18抗体，借3ul来试一次。
还有，ResearchGate 上可以输进去你的产品公司的Cat # 和Clone的编号，看看有没有人用过你这个抗体，以及他们一般是用什么抗体。另外，还可以把你的Cat # 在网上搜一下（NCBI里面，或者google scholar 也行）相关文献，看那些用了你的抗体的文献里面他们的WB图怎么样，用的是什么细胞，有没有特殊的实验步骤（比如你说的同时收集培养液，但说实在，用培养液的话，就不能用WB，简单点的方法就是用RT-qPCR测细胞mRNA，或者enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)）。
不论怎样，先要验证你的IL-18抗体是好的，第二要验证是否你的细胞是能够表达足够量的IL-18的，所以这个一般用RT-qPCR更容易确定一点，如果mRNA都测不到，那蛋白你是一定看不到了。另外，IL-18在免疫细胞中表达量比较高，你们实验室如果有免疫细胞，复苏一个，或者跟隔壁实验室借一flask，跑个WB看看有没有条带。
还有，尽量别太相信公司网站给出来的WB效果。。。如果你在其他文献里完全找不到别人在用，大概率抗体很不好用。

检验医师

提取蛋白的时候用了蛋白酶抑制剂吗？是不是考虑蛋白降解了？
IL-18是generate了stable cell line还是直接transfection？是否可以考虑在IL18前加入一些epitote tag （Flag，HA，etc.）帮助确定？
抗体买了多久了，哪个公司的，抗体网站上给出的参考文献条带位置在哪？