这么全的FISH（荧光原位杂交）技术全攻略，必须拿小本本记下来！

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随着当代医学的进展，除了传统的传统病理学技术外，分子病理学在疾病的诊断、靶向位点筛查和预后分层等诊疗全过程中正扮演着日益关键的角色。在众多分子病理学技术中，荧光原位杂交技术（FISH）作为其中最基础且至关重要的一项，正在发挥着无法替代的价值。那么，FISH技术究竟是什么？其主要用途和实验流程又是怎样的？

一、简介

荧光原位杂交（FISH）技术是一种高级的核酸分子杂交方法。该技术利用已知的荧光标记的单链核酸作为探针，根据碱基互补的原理，通过经历变性、退火和复性等过程，特异性地与待检样本中的未知单链核酸结合，形成可以检测的杂交双链核酸。通过使用荧光显微镜观察和计数荧光信号，从而能够检测和诊断染色体或基因异常的细胞和组织样本。这一技术为各种基因相关疾病的分类、预测和预后提供了准确的依据。

二、常见的FISH临床应用有哪些：

在实体肿瘤中应用
1.指导靶向药物的应用，例如乳腺癌中的赫赛汀（HER2）以及肺癌中的克唑替尼（ALK/ROS1/CMET）等，旨在通过对分子病理信息的准确分析，实现个体化治疗方案的制定。
2.用于指导肿瘤的预后评估，例如对于脑胶质瘤，通过检测1p和19q的缺失情况，以及神经母细胞瘤和分化型神经母细胞瘤中的NMYC表达等，从而提供对肿瘤发展和患者预后的精准信息。

在淋巴造血肿瘤中的应用
1.通过分子病理学技术明确各种血液肿瘤的诊断，如急性早幼粒白血病中的t(15;17)、慢性粒细胞白血病中的t(9;22)、套细胞淋巴瘤中的t(11;14)、Buikitt淋巴瘤中的c-MYC基因重排，以及双打击及三打击淋巴瘤中的MYC、BCL2、BCL6等基因变异。这些特异性分子标志物的检测为准确诊断不同血液肿瘤提供了重要依据。

2.在血液肿瘤领域，对于急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤等疾病，通过危险分层的手段，实现对患者的风险评估，为制定个性化的治疗方案提供有力支持。

3.进行染色体隐蔽易位或无法通过常规细胞遗传学检测的异常的检测。

4.对微小残留病变进行定量分析，同时评估大量分裂和非分裂细胞，以判定细胞遗传学缓解和复发情况（其灵敏度相较于实时定量PCR较低）。
荧光原位杂交技术在基因定位中的应用
基因定位是荧光原位杂交的最基础最成功的应用。利用荧光原位杂交灵敏、准确，并且可以一次检测多段基因等特点，可以确定目标基因的准确位置，确定几个基因之间的位置关系，以及基因与染色体端粒之间的关系，基因与着丝点的关系，是构建基因图谱的基本要素。目前荧光原位杂交技术被广泛地应用于基因的物理定位及基因图谱的绘制

三、实验原理

通过使用已知的标记单链核酸作为探针，根据碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸异性结合，形成可检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上呈线性排列，这使得探针能够直接与染色体发生杂交，从而实现特定基因在染色体上的定位。



（图片来源于网络）

FISH DNA探针的分类
FISH DNA探针可划分为位点特异性探针和着丝粒探针，其中位点特异性探针又可细分为计数探针和融合/分离探针。在临床应用中，位点特异性探针目前更为广泛使用。
计数探针采用标记特异性DNA片段的方式，通过计算信号数量来判断染色体或基因状态的一种标记探针。由于正常人的染色体/基因是二倍体，因此正常检测信号数为两个。当信号数多于两个或少于两个（排除切片影响）时，可推断染色体或基因发生了异常（扩增或缺失）。



扩增表现



缺失表现

融合/分离探针在基因发生重排时，会在相对稳定的位置发生断裂。该探针利用不同颜色的荧光素标记断裂点两端的特异性DNA片段，通过观察信号点颜色的变化来判断是否发生了融合或分离事件。在基因未发生重排时，探针标记的红绿信号由于相隔距离太近，会在肉眼观察下呈现混色（黄色）。当发生断裂时，形成独立的颜色信号（单独的红色或绿色）。当然，结构探针同样能够指示数目异常，如多倍体情况。



断裂表现



融合表现

四、实验材料准备

实验用具及材料
1.人的 MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色体细胞标本；
2.指甲油、甲酰胺、NaCl、柠檬 酸 钠、氢氧 化钠、吐温 20 等；
3.恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400 荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。
相关溶液的配制
（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g 柠檬酸钠，加水至 1 000 mL（用 10 mol/L NaOH调 pH 至 7.0）。
（2）去离子甲酰胺（DF）：将 10 g 混合床离子交换树脂加入 100 mL 甲酰胺中。电磁搅拌 30 min，用 Whatman l 号滤纸滤。
（3）体积分数 70%甲酰胺/2×SSC：35 mL 甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL 水。
（4）体积分数 50%甲酰胺/2×SSC：100 mL 甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL 水。
（5）体积分数 50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
（6）杂交液：8 μL 体积分数 25%DS，20 μL 20×SSC 混合。（或 40 μL 体积分数 50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O 混合）取上述混合液 50 μL，与 5 μL DF 混合即成。其终浓度为体积分数 10% DS，2×SSC，体积分数 50% DF。
（7）PI/antifade 溶液
PI 原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为 100 μg/mL，取出 1 mL，加 39 mL 双蒸水，使终浓度为 2.5 μg/mL。Antifade 原液：以 PBS 缓冲液配制该溶液，使其浓度为 10 mg/mL，用 0.5 mmol/L 的 NaHCO3 调 pH 值为 8.0。取上述溶液 1 mL，加 9 mL 甘油，混匀。PI/antifade 溶液：PI 与 antifade 原液按体积比 1:9 比例充分混匀，－20℃保存备用。
（8）DAPI/antifade 溶液：用去离子水配制 1mL/mg DAPI 储存液，按体积比 1:300，以antifade 溶液稀释成工作液。
（9）封闭液 I：体积分数 5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
（10）封闭液 II：体积分数 5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL 混合。
（11）荧光检测试剂稀释液：体积分数 5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL 混合。
（12）洗脱液：100 mL 20×SSC，加水至 500 mL，加 Tween20 500 μL。

五、实验步骤：

探针变性
在75℃的恒温水浴中，对探针进行温育5分钟，然后迅速将其置于0℃，持续5至10分钟，以完成双链DNA探针的变性过程。
标本变性
（1）将准备好的染色体玻片标本放置于50℃的培养箱中烤片2至3小时。（对经Giemsa染色的标本，在烤片前需先在固定液中进行褪色处理）。
（2）将玻片标本取出，浸泡在70～75℃的70%甲酰胺/2×SSC变性液中，进行2～3分钟的变性处理。
（3）立即按照顺序将标本在70%、90%和100%体积分数的冰乙醇中进行脱水处理，每个浓度持续5分钟，然后进行空气干燥。
杂交
取已变性或预退火的DNA探针10μL滴在已变性且脱水的玻片标本上，覆盖18×18盖玻片，用Parafilm密封，放置于37℃的湿暗盒中进行杂交，持续过夜（大约15～17小时）。由于杂交液较少，温度相对较高，而且持续时间较长，为了保持标本的湿润状态，该过程在湿盒中进行。
洗脱
执行此步骤有助于去除非特异性结合的探针，有效降低背景信号。
（1） 在杂交的第二天，从37℃温箱中取出标本，轻轻使用刀片揭开盖玻片。
（2） 将已完成杂交的玻片标本放入预热至42～50℃的50%甲酰胺/2×SSC溶液中，进行3次洗涤，每次5分钟。
（3） 在已升温至42～50℃的1×SSC中进行3次洗涤，每次5分钟。
（4） 在室温下，轻轻将玻片标本在2×SSC中漂洗一次。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200μL的复染溶液（可以是PI/antifade或DAPI/antifade染液），滴在玻片标本上，然后盖上盖玻片。
对杂交信号进行放大（适用于使用生物素标记的探针）
（1） 在玻片的杂交部位加 150 μL 封闭液 I，用保鲜膜覆盖，37℃温育 20min。
（2） 去掉保鲜膜，再加 150 μL avidin-FITC 于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育 40 min。
（3） 取出标本，将其放入已预热 42～50℃的洗脱液中洗涤 3 次，每次 5 min。
（4） 在玻片标本的杂交部位加 150 μL 封闭液 II，覆盖保鲜膜，37℃温育 20 min。
（5） 去掉保鲜膜，加 150 μL antiavidin 于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育 40 min。
（6） 取出标本，将其放入已预热 42～50℃的新洗脱液中，洗涤 3 次，每次 5 min。
（7） 重复步骤（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室温清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。（9） 取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
封片
可以选择采用不同类型的封片液。如果封片液中未包含Mowiol（这有助于产生自封闭效应），为了防止盖片与载玻片之间的溶液挥发，可以在盖玻片周围使用指甲油进行封闭。经过封闭处理的玻片标本可在-20℃至-70℃的冰箱内的暗盒中保存数月。
荧光显微镜观察 FISH 结果
首先，在可见光源下定位显示细胞分裂相的视野，然后启动荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。通过PI染色，细胞呈现红色，而由FITC标记的探针位置则发出绿色荧光。

六、案例展示



图片来源于网络

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