前沿 | CRISPR+侧向层析技术！荷兰研究人员开发出生物自发光传染病即时检验试剂！

检验之星

荷兰埃因霍温科技大学的研究人员开发了一种传染病分子检验方法，该方法使用生物发光蛋白做为显色系统，研究人员希望该产品最终能在护理点发挥作用。
该技术利用重组聚合酶扩增（RPA）和CRISPR-Cas9酶来检测各种类型样本中的RNA和DNA，本周发表在《ACS CENTRAL SCIENCE》杂志上的一篇新论文[1]描述了这一技术。


埃因霍温科技大学的生物医学工程教授Maarten Merkx说，研究人员被创造一种分子测试替代PCR的愿望所驱使，要知道PCR在SARS-CoV-2大流行期间至关重要，但需要特定的设备，并可能需要几个小时才能得到结果。因此，该团队希望开发一种比传统PCR快得多但仍然高度灵敏的方法，因此其发光核酸传感器，即LUNAS平台诞生了。
这种两步法除了一个加热器和数码相机之外不需要任何仪器设备，并在大约20分钟内得到结果，因为这两个步骤是在同一个样品中同时进行的。在《ACS CENTRAL SCIENCE》论文的案例中，研究人员使用了鼻咽拭子，该样本使用RPA进行扩增，它需要一个相对较低的温度，大约40摄氏度。Merkx指出，较低的温度是该团队选择RPA而不是更常见的扩增方法的主要原因，比如循环介导的等温扩增。
当样品被扩增时，为检测目标而加入的试剂被激活。这些试剂构成了研究人员所说的“传感器”，由两个CRISPR-dCas9蛋白组成，其中的引导RNA被设计为与SARS-CoV-2的特定序列结合，以及一个底物。这两种蛋白质还包含一些荧光素酶，当与目标结合时，形成一种活性酶，与试剂混合物中的底物反应并产生蓝光。
虽然各种测试都使用荧光或其他检测方法，但Merkx说，这些方法与RPA一起使用时，会产生光散射效应，导致背景噪音。生物发光不存在这个问题，因此测试中发出的所有光都来自反应本身，这使得它对血液等更复杂的样本特别有效。
然而，产生的蓝光对样品中底物的浓度、温度和时间很敏感。为了减轻结果的潜在波动，研究人员添加了第二种酶，该酶产生绿光，也对温度、底物浓度和时间有反应，但对DNA或RNA没有反应，从而补偿了一切可能影响生物发光的因素。因为随着时间的推移，发光的强度会随着底物的耗尽而降低，所以有一个也受底物浓度影响的校准品可以确保结果可以针对该变量进行校正，并且测试对时间不敏感。蓝光与绿光的比率由数码相机测量，如果比率通过控制水平，则测试结果为阳性。
在《ACS CENTRAL SCIENCE》的论文中，研究人员用RNA分离物和普通的鼻咽样本验证了该测试，并发现在具有低周期阈值（Ct）的RNA分离物样本中，这表示样本中含有高浓度的SARS-CoV-2 RNA，该测试识别了所有与RT-PCR相关的阳性。研究人员指出，对于未提取的样本，灵敏度略低。对于那些Ct值较高、RNA浓度可能较低的样本，该测试正确识别了25个阳性拭子样本中的21个和55个阳性RNA分离物样本中的43个，也就是灵敏度为84.0%，特异性为78.2%。对于这两种类型的样本，所有真正的阴性样本都被该检验所识别，包括那些对其他呼吸道病毒呈阳性的样本。
研究人员补充说，通过增加样本输入量，减少拭子收集介质的体积，或在RNA提取步骤中采用更高的倍数浓度，可能会进一步提高灵敏度。
Merkx还指出，除了添加试剂和孵化之外，几乎不涉及样品处理，因此不需要专业的知识。这种灵活性为它在护理点的使用做好了准备，这也是研究人员的目标，尽管在它上市之前仍有多个步骤。现在，这种测试可以很容易地在实验室环境中实施，但对于护理点来说，它需要被整合到一个带有特定读卡器的试剂盒或设备中--这些步骤最好由公司而不是研究团队来完成。
研究人员已经开发了其他生物发光测定法，并有一家创业公司Lumabs将其商业化，但该创业公司的重点是免疫测定而不是分子测试。Merkx说，由于将生物发光用于护理点测试相对较新，市场上还没有很多大的商业参与者，但该团队愿意与任何想要将该测试商业化的各方建立伙伴关系。
Sherlock Biosciences公司已经开发了它的INSPECTR（内部分裂配对表达盒翻译反应）平台，这是一个基于合成生物学的系统，可以在室温下通过生物发光信号进行编程，根据单个核苷酸来区分目标，但很少有其他公司利用生物发光技术进行诊断。
然而，其他研究人员已经利用生物发光进行核酸检测，包括一个由北京大学和中国科学院的研究人员组成的中国团队，该团队利用与荧光素酶相连的dCas9蛋白开发了一个DNA检测系统来检测结核病[2]。设在日内瓦大学的一个小组开发了一种基于荧光素的方法来检测微RNA，这在2020年发表在《ACS CENTRAL SCIENCE》杂志上的一篇论文[3]中有所描述。


同时，来自华盛顿大学大David Baker实验室的研究人员上个月在《Nature》杂志上发表了一篇论文[4]，解释了使用深度学习方法开发新的荧光素酶，可能会在医学和生物技术方面有应用。


2020年论文的作者、日内瓦大学有机化学教授Nicolas Winssinger没有参与LUNAS测试的创建，他通过电子邮件表示，Merkx团队的工作“非常出色”，并指出有类似的技术，但它“在提供实时监测和产生比率测量读出方面是独一无二的”，这种组合“使它具有非常吸引人的稳健性”，尽管它仍然需要进行临床验证。
Merkx说，只要对RPA引物和引导蛋白进行修改，该测试还可用于SARS-CoV-2以外的任何传染病或RNA或DNA检测应用。虽然该团队从SARS-CoV-2开始，因为这是在大流行期间“显而易见的事情”，但他们也在探索将其用于性传播感染，并设想将其用于普通医生的办公室以获得快速和准确的结果。该技术的第一个商业应用可能不是SARS-CoV-2，因为这将取决于可能授权该技术的任何公司的商业战略。但是“由于该平台是通用的，可以考虑许多可能的应用”。
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参考文献

• Glow-in-the-Dark Infectious Disease Diagnostics Using CRISPR-Cas9-Based Split Luciferase Complementation. Harmen J. van der Veer, Eva A. van Aalen, Claire M. S. Michielsen, Eva T. L. Hanckmann, Jeroen Deckers, Marcel M. G. J. van Borren, Jacky Flipse, Anne J. M. Loonen, Joost P. H. Schoeber, and Maarten Merkx. ACS Central Science Article ASAP. DOI: 10.1021/acscentsci.2c01467
  
• Paired Design of dCas9 as a Systematic Platform for the Detection of Featured Nucleic Acid Sequences in Pathogenic Strains. Yihao Zhang, Long Qian, Weijia Wei, Yu Wang, Beining Wang, Pingping Lin, Wenchao Liu, Luze Xu, Xiang Li, Dongming Liu, Sida Cheng, Jiaofeng Li, Yixuan Ye, Hang Li, Xiaohan Zhang, Yiming Dong, Xuejin Zhao, Cuihua Liu, Haoqian M. Zhang, Qi Ouyang, and Chunbo Lou. ACS Synthetic Biology 2017 6 (2), 211-216. DOI: 10.1021/acssynbio.6b00215
  
• Smartphone DNA or RNA Sensing Using Semisynthetic Luciferase-Based Logic Device. Dalu Chang, Ki Tae Kim, Eric Lindberg, and Nicolas Winssinger. ACS Sensors 2020 5 (3), 807-813. DOI: 10.1021/acssensors.9b02454
  
• Yeh, A.HW., Norn, C., Kipnis, Y. et al. De novo design of luciferases using deep learning. Nature 614, 774–780 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05696-3
  

原文链接（英文）
https://www.360dx.com/infectious-disease/dutch-researchers-craft-glow-dark-poc-infectious-disease-test#.ZBep03ZByXc
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