科研课堂——免疫荧光技术

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免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。


原理


根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

基本步骤
切片准备—固定—通透—封闭—一抗结合—二抗结合—封片及检测




基本注意事项
（1）目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果。确认目标蛋白在该组织或细胞的表达丰度如何；如果抗体修复不充分，抗原表位未完全暴露，也会出现弱标记现象。
（2）目标蛋白的荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果。适当降低一抗或者二抗的浓度，增加漂洗时间。
  (3) DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色。
  (4) 组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色。石蜡切片脱蜡环节不彻底，也会造成区域性的非特异性标记。
（5）采集图像过程不当，导致原始图像不佳，直接影响后续半定量分析。采集图像时，必须固定一个γ值，不可以在采集过程中修改。

常用的荧光素特性
（1）异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉，吸收光 490~495nm，发射光 520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
（2）四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine-isothiocyanate，TRITC）为紫红色粉末，吸收光 550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。‍
（4）藻红蛋白（PE），吸收光 490~560nm，发射光 595nm，红色荧光。
（5）Cy3 (Cyanine 3) 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料，吸收光 550nm，发射光 570nm左右，橘红色荧光。
（6）Cy5 (Cyanine 5) 是一种发远红荧光的花青素荧光染料,吸收光650nm，发射光 690nm左右，红色荧光。

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