免疫层析法和胶体金法的不同?

检验之星

如题
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清风寡欲

免疫层析技术是一种简便、快速的诊断方法，也是现场即时检测（Point of care testing， POCT）的重要工具，最早用于人绒毛膜促性腺激素HCG的检测，以此作为早期怀孕的诊断依据。

        免疫层析技术主要借助免疫层析试纸条完成，免疫层析技术不仅操作简便、检测快速、特异性强、稳定性好，而且携带方便，已广泛应用于临床诊断、食品安全、药物检测、环境污染等领域。
       目前，市场上基于免疫层析检测产品的数量持续上升，主要是由于试纸条的各组件价格低廉，性价比高，适合现场快速检测和诊断。近年来，一些纳米材料（如量子点、磁纳米粒子、上转换纳米粒子等）被应用于免疫层析检测研究中，提高了检测的灵敏度，并实现了定量检测。贵金属纳米粒子，特别是金和银纳米粒子，具有与其自身及外界环境相关的局域表面等离子体共振（LSPR）光散射性质，适于作为光散射分析探针。
       近年发展最为成熟的胶体金免疫层析技术，是以胶体金纳米颗粒作为免疫标记物的一种免疫层析检测方法，结果判读直观，并且无需任何仪器设备，因而引起了广泛关注。
        胶体金免疫层析技术是一种新型的体外诊断技术，胶体金是显色物，硝酸纤维膜是载体，能够在层析的过程中达到检测的目的。它的应用范围非常的广泛，胶体金标记技术标记物的制备非常的简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，胶体金是由氯金酸在还原剂的作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。




       胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与SPA、PHA、ConA等大分子相结合，根据胶体金的物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性。它适用非常的方便和快速，所有的反应都能在15分钟内完成，其本身是红色，不需要加入发色试剂，对人体无害，标记物也很稳定，标记样品可以在4℃下贮存两年以上。

胶体金免疫层析技术原理
胶体金免疫层析试剂条最底层是保护层，次底层一般都是硝酸纤维素膜，在它上面固定了检测蛋白。连接着膜的是包含有干燥剂金标的金标垫，在现有的大部分是试纸条中，金标垫的金颗粒能特异性与检测物中的抗体或抗原结合。样品垫通常是纸，粘贴着金标垫。当液体样品滴在样品垫的时候，液体由毛细管作用力扩散通过金标垫，干燥金标遇水以后便于样品中的分析物结合。

免疫胶体金制备
生物纳米颗粒在免疫测定中性能取决于蛋白质生物活性，制备胶体金质量关乎试条特性。胶体金制备法分为理化法，物理法包括热分解法等。常用的为化学还原法，还原剂原理为使金粒子还原变位金原子，可制备不同大小胶体金颗粒。胶体金粒径与制备加入柠檬酸钠量相关，可通过测定吸光度确定胶体金颗粒大小。免疫胶体金制备是胶体吸附到胶体金表面，受到电解质等多方面的影响。免疫胶体金标记步骤为将蛋白质用双蒸水透析除去电解质，用0.1mol/L的K2CO3调节胶体金pH，标记蛋白适当稀释后滴加入胶体金中，滴加10%的BSA至浓度0.5%搅拌1h终止反应。加入等体积1%BSA溶液，获得胶体金探针保存备用。

胶体金免疫层析的方法
胶体金免疫层析当下的检测方法非常的多，有间接法、夹心法、双抗体夹心法、竞争法以及捕获法。

• 间接法是用胶体金来标记二抗，像是没有标记的特异性与已知抗原结合，间接法经常是用在检测血清样本中的病毒上；
  
• 双抗夹心法就是用在检测病原微生物性的大分子抗原，早早孕试纸就是用这个方法；
  
• 竞争法经常用在滥用药物、吗啡、农药残留等检测上；
  
• 捕获法是用在风疹病毒、艾滋病等检测上。
  

       尽管胶体金免疫层析技术具有偶联过程简单、可肉眼直接观察结果等优点，但胶体金通过疏水键与蛋白偶联形成免疫标记探针，其稳定性易受环境中离子浓度和pH值的影响，且胶体金免疫层析试纸条的灵敏度普遍不高，难以实现定量测定。因此，许多研究工作正围绕着寻找新的标记材料而展开。

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摘录部分金标抗体：



参考资料：
1.张婳，李群，刘桂锋.金纳米棒免疫层析试纸条定量检测前列腺特异性抗原.分析化学，2020(8).
2.https://www.fx361.com/page/2021/0510/10303650.shtml
3.https://www.fx361.com/page/2020/1012/7089111.shtml

清风寡欲

免疫电镜是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质,使其与抗体相吸附,从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时,在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色,不需加外进行染色。在电镜水平,金颗粒具有很高的电子密度,清晰可辨。因此,免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面,并取得了长足的进展,解决了一些过去未能解决的问题,80年代以来似有取代免疫电镜PAP技术的趋势。胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点:而PAP法则烦琐的多,胶体金法不需用H202等损伤微细结构的处理步骤,对微细结构的影响较少。其次,金颗粒具有很高的电子密度,在电镜下金颗粒清晰可辨,易于与其他免疫产物相区别。
因此,金标法还可以和PAP法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。另外,利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体,是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。金标抗体还可加入培养液中,对培养细胞内抗原进行标记定位。曾有报告用金标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。由于金具有强烈的继发电子的能力,因此,不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察,也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。金标液无毒性,对人体无损伤。在原位分子杂交技术在电镜水平的应用中,胶体金的标记术被科技工作者认为是当前的标记物。
电镜水平的免疫金染色法

应用于电镜水平的免疫法,可分为包埋前染色和包埋后染色,由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差,一般只用于细胞表面的抗原标记,如需穿透细胞膜,则需辅以冻融法或加入Triton X-100、皂素等活性剂,后者会加重细胞超微结构的破坏,因此,现较普遍采用包埋后染色,现分别介绍如下:
1.包埋后染色

(1)超薄切片厚50~70nm左右,载于200~300网孔的锦网上。
(2)置1%H202内10min至1h(视树脂的硬度和切片的厚度而定),以去钱酸和增进树脂穿透性,有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时,此步可省略。操作时,滴入1%H202液1滴于蜡板上,将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片,有主张以1%过碘酸钟(KI04)代替H202的。
(3)双蒸水洗3次,每次10min,第1,2次洗法如(2),浮于液滴上,第3次以盛双蒸水的注射器沿锦网面冲洗,水流应有适当压力,但不宜过高强,用滤纸在网缘将水吸干。
(4)浮于正常羊血清(1: 50~1: 100)滴上,室温30~60min,以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位。
(5) PBS漂洗3min,洗1次(有人主张不洗)
(6)滤纸吸干,孵育于*抗体血清滴上,先室温预孵1h,再置于4℃24~36h。
(7) PBS漂洗3min, 3次。
(8) PBS (内含1%的牛血清白蛋白)pH8.2中, 5min,此步为胶体金结合作准备。
(9)胶体金标记抗体液1: 30~1: 100,淡红色为适宜稀释液,室温孵育10min至1h。
(10)双蒸水洗3min, 3次。如作双重染色,则应将锦网翻过来,用另一类抗体血清,重复上述步骤(2)~(10)
(11)5%醋酸轴(双蒸水配制)染5min,然后用双蒸水洗。
(12)枸橡酸轴(或醋酸铅)染色5min,双蒸水洗净。
(13)电镜观察。
2.包埋前染色

(1)组织经过适当固定,为增强细胞穿透性,可在固定液中加入皂角素(Saponin) ,使其浓度为0.01%,经含皂角认固定剂处理5~8min后,应用0.01mol/L PBS Ph7.4冲洗12h左右,中间换洗3~4次。
(2)组织切片贴于明胶涂抹的坡片上,细胞可制成混悬液,用离心法操作或制成涂片。
(3) 0. 05mol/L PBS pH7. 4洗3min.
(4)以1:5正常羊血清处理切片30min室温,以阻断非特异性吸附。
(5)*抗体4℃孵育20h后室温2h或过夜。
(6) 0. 05mol/L TBS pH7. 4洗3min X3
(7) 0. 02mol/L TBS pH8. 2洗3minX3,为与胶体金结合作准备。
(8)再次阻断非特异性吸附,同(4)。
(9)以金标记的第二抗体(工作浓度1: 40左右)在室温下孵育1h。
(10) 0. 05mol/L TBS pH8. 2洗3min
(11) 0. 05mol/L TBS pH7.4洗3minX3
(12) 1%饿酸(0. 1mol/L PBS溶液) 1h。
(13)双蒸水洗15min。
(14)系列酒精或丙酮脱水,包埋、超薄切片。
(15)构椽酸铅对照染色。
为增加抗非特异性染色,有的实验室倾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA,Sigma) 。理想的免疫金染色切片,背景应清洁,无残留的金或其他无机盐颗粒,金粒集中在抗原、抗体反应部位。要获得理想的免疫金染色切片,需注意的因素很多,其中主要的如: ①抗体血清的高度特异性和亲和力; ②被检组织应有较高浓度的抗原; ③冲洗液的清洁度,冲洗的彻底程度以及整个过程中应用的各种器皿的清洁度等;④所有溶液用微孔滤过器(milipore filter滤过),滤膜孔径0.2~0.45μm,所有器血应清洁和。整个操作过程应在湿盒内进行,以使载网保持湿润。

检验医师

免疫层析法是一个大类，利用特异性抗原抗体免疫结合反应的原理，加上试纸条层析技术的一种方法。
而胶体金法是免疫层析法的一个分类，用胶体金标记抗原抗体。
像荧光标记就是免疫荧光法，乳胶微球标记就是如叫法，还有量子点法等，这些用到层析技术的都是免疫层析法。

继续前进

完全不同。

免疫层析法是一种分析技术；
胶体金法是一种标记技术。

免疫层析法不一定用胶体金作为标记物；
胶体金法不仅仅应用于免疫层析。

清风寡欲

免疫层析是个泛指的概念，可以细分，依据所使用的示踪物可以分为胶体金法和荧光法