Western blot （WB）条带灰度值测量从原理到实践

HaHa

1 背景知识介绍
Western Blotting(蛋白质印迹或免疫印迹)是检测组织匀浆或提取物样品中特定蛋白质的重要技术。在进行Western Blot检测时，明智的做法是一步一步地进行操作。要成功地进行Western Blot，每一步都不应该被忽视。包括:(1)WB缓冲液制备，(2)样品制备，(3)凝胶电泳，(4)蛋白转移，(5)封闭，(6)抗体培养，(7)WB检测与成像，(8)数据分析。



（图1 western blot大概的一个流程示意图）

1.1 凝胶电泳（Gel Electrophoresis）
在这一步中，我们将使用正极吸引带负电的蛋白质，根据分子量分离样品裂解液中的单个蛋白质。为此，我们将先前制备的蛋白质样品加入（load）聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶有固定百分比或梯度的丙烯酰胺。丙烯酰胺含量越高，凝胶基质的孔径越小。因此，高百分比的凝胶对低分子量蛋白质更好，低百分比的凝胶对大蛋白质有用，梯度凝胶可用于各种大小的蛋白质，因为它们的孔径范围不同。准备凝胶，将其插入电泳仪并填充适合凝胶化学的运行缓冲液。用流动缓冲液冲洗凝胶孔，并在腔室中加入缓冲液。将样品装入孔中，并将预染色（loading buffer，在蛋白变性的时候意见加入）的分子量梯装入一个孔中。loading buffer将允许您在电泳过程中监测蛋白质分离，随后在随后的分析中验证样品中的蛋白质重量。大多数装置通常在200伏下运行45-60分钟，或者直到加载缓冲液到达凝胶的底部。在此期间，每个样品中的带负电荷的蛋白质将向带正电荷的电极迁移，使其通过聚丙烯酰胺凝胶基质。
1.2 转膜（Transfer）
在这一步中，我们将把分离的蛋白质从凝胶中转移到固体膜或印迹（PVDF）中。这是基于与前一步相同的原理，其中电场带电使负的蛋白质向正极移动。转移可以发生在潮湿或半干燥的条件下（wet or semi-dry）。传统湿转移法的步骤如下:首先将凝胶从其盒中取出，切割包含孔的顶部。在左上角刻上缺口以指示凝胶的方向。将凝胶浮于转移缓冲液中，同时制备转移多层操作，多层操作制作如下：需要一个卡带、海绵、滤纸、凝胶和PVDF或硝化纤维素膜纸。在吸墨纸的左上角切割小角，指示条带方向，将膜在转移缓冲液中孵育一定时间（一般时间是根据条带大小而定，一般湿转是2h）。从黑色负极到红色正极依次堆叠:海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵(注意不要用手接触凝胶或膜，请使用干净的镊子或抹刀)。在任何阶段接触膜都可能污染印迹并导致过量的背景信号)。每一层都要用一个干净的滚轮轻轻地滚出可能存在的气泡，因为气泡会抑制有效的蛋白质转移。锁定所述卡带并将其置于包含冷转移缓冲的转移装置中，确保所述卡带从负极到正极正确定位。为了防止热量积聚，在仪器中或在冷室中使用冷敷包进行转移，并将旋转棒放置在室的底部。关闭腔室并接通电源。根据制造商的说明进行转移，通常为100伏，持续三分之一到120分钟。
1.3 免疫印记（Immunoblotting）
在将蛋白质电转移到膜上之后，我们现在将通过应用针对我们感兴趣的蛋白质的一抗和识别一抗的二抗来阻断印迹。我们需要阻断印迹中所有不含蛋白质的区域。这将防止抗体的非特异性结合，并减少整体背景信号。常见的阻断缓冲液包括5%脱脂干牛奶或BSA在TBST溶液。将膜与封闭液在室温下摇床中轻微孵育1小时，然后用TBS清洗5分钟（3次）。按抗体说明书表上推荐的浓度稀释一抗，在4摄氏度下摇床轻轻摇晃孵育过夜。
第二天:回收一抗并用大量TBS清洗膜，剧烈搅拌3次，每次5分钟。这些严格的清洗对于去除非特定的背景信号非常重要。洗涤后，使用稀释二抗，并按数据表上推荐的浓度在室温下孵育膜1小时，然后使用用大量的TBS间液冲洗膜，剧烈搅拌5次，每次5分钟。
1.4 检测（Detection）
在最后阶段，利用HRP（horseradish peroxidase）酶偶联到二级物上，催化ECL（enhanced chemiluminescence）反应产生光。然后，光被收集到x射线胶片上，在足够灵敏的专用相机的帮助下进行显影或数字化。
我们首先根据说明书，A液和B液以1:1的比例混合制备ECL试剂。将在暗盒中膜孵育3-5分钟，不搅拌。孵育后，吸干ECL混合物，并用实验室擦拭器从膜的角吸去多余的显色液。将薄膜放在透明的保鲜膜中，如薄膜保护膜，以防止干燥（选择性操作）。现在我们可以用滚轮把气泡或多余的溶液挤出来。立即展开膜。胶片和相机系统都允许我们手动调整曝光时间，以确保画面完美。



（图2 western blot 检测目标蛋白信号示意图）

2 免疫印迹（western blot）灰度值（gray scale）计算实操
2.1 image J 分析灰度值
2.1.1 打开 image J；



（图3 image J打开界面）

2.1.2 打开需要分析的图片：“file- open- 找到图片”；



（图4 打开需要分析图片界面展示，此处展示的内参β-ACTIN）

2.1.3 将图片转换为灰度图：“image- type- 8 bit”；



（图5 western blot 图片转换为灰度图设置）

2.1.4 将图片背景灰度统一：“process- Subtract Background”，然后将“rolling ball radius，参数设置为50”，复选框选中light background；此处的设置能够消除背景的影响；



（图6 图片背景灰度统一设置）



（图7 图片背景灰度统一设置参数调整）



（图8 完成灰度背景统一设置后图片展示）

2.1.5 翻转图片的黑白：“edit- invert”；



（图9 图片黑白翻转设置）



（图10 图片黑白翻转后展示）

2.1.6 分析测量设置：“Analyze>Set Measurements，选择Area面积、平均灰度值Mean gray value、极大小灰度值 min& max gray value、积分灰度值Integrated dendity”；



（图11 测量参数设置命令操作）



（图12 参量参数复选框设置）

2.1.7 将测量的单位设置为像素 pixels：“analyze- set scale”；



图13 测量单位定义为像素 pixels设置）



（图14 设置为像素的相关设置，并定义到全部Global）

2.1.8 条带的选择和对应光密度的测量：图15红色箭头指向，分别表示举行，椭圆、和不规则图形，我一般比较喜欢用矩形选框；



（图15 选择条带的框）

2.1.9 测量印记的灰度值，使用矩形/椭圆/不规则选框选择需要测量的印记，然后使用快捷键（ctrl + M）或者菜单命令“analyze- measure”；



（图16 选中需要测量的印记条带）



（图17 测量结果展示，红框标记部分IntDen即为本次测量的光密度数值）

2.1.10 数据导出：file- save as；



（图18 数据导出设置）



（图19 导出数据命名设置）

同样的操作将目标蛋白进行灰度值/光密度测量，这里就不再继续了。



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