PCR原理三个基本步骤常见的PCR技术？

虎威将军

想比较基础的但是全面的了解，包括什么是PCR？PCR的反应体系、PCR循环的三个基本步骤、常见的PCR技术等方面

原文地址：https://www.zhihu.com/question/293723907

长长的路

一.PCR简介
生物学可以被划为两个时代：一个没有PCR，一个有PCR。没有PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）技术，就没有现代分子生物学。PCR技术发明者Kary Mullis，在1993年获得化学诺贝尔奖，世界称之为PCR教父。
生物体的基因组存储在DNA分子内部，但是分析这种遗传信息需要大量的DNA。1985年，Kary Mullis发明了一种有效的方法，该方法可在短时间内大量复制少量DNA。通过加热，DNA分子的两条链被分离，并且已添加的DNA构件与每一条链结合。借助酶DNA聚合酶，可以形成新的DNA链，然后可以重复该过程。PCR在医学研究和法医学领域都具有重要意义。
二.PCR是干什么的?
PCR全称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction），是一种非常强大的技术，可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制DNA，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
三.PCR的原理是什么?
我们知道DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，而另一条链是新合成的，因此这种复制方式称为半保留复制。
用简单的方式来理解PCR就像是 “心灵手巧的小姑娘学习织围巾” 在织围巾(PCR)的过程中，首先拆解原始织样得到元素织样(模板DNA)、起针(引物对)、毛线(dNTP)和针(Taq酶以及缓冲液体系)串起来，让DNA分子无处可逃。




四.PCR实验基本步骤
PCR反应准备工作
1.PCR反应体系

• 10×扩增缓冲液 10μl
  
• 4种dNTP混合物（终浓度） 各100～250μmol/L
  
• 引物（终浓度） 各5～20μmol/L
  
• 模板DNA 0.1～2μg
  
• Taq DNA聚合酶 5～10 U
  
• Mg2+（终浓度） 1～3mmol/L
  
• 补加双蒸水 100 μl
  

其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整，以上数据仅供大致参考值。PCR反应五要素：

• 引物：(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。
  
• 酶：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。
  
• dNTP包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP
  
• 模板：模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。
  
• 缓冲液：（其中需要Mg2+）
  缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：
  缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；
  一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；
  二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；
  辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。
  
  2.PCR引物设计
  

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

• 引物设计的基本原则
  

• 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
  
• 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
  
• 引物内部不应出现互补序列。
  
• 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
  
• 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
  
• 引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
  
• 引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
  

3.模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、、毛发等。
标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
4.反应的控制

• PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子
  
• 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
  
• 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
  
• TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
  
• 引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
  
• 反应温度和循环次数
  

• 变性温度和时间 95℃，30s
  
• 退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
  
• 延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）
  
• Tm值=4(G+C) +2(A+T)
  

循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”
循环参数设置
1.预变性：模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2.变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。3.引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。4.引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。5.循环数：大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。6.最后延伸：在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
PCR反应步骤
标准的PCR过程分为三步：
DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，
从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。




PCR反应特点
1.特异性强

PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
2.灵敏度高
3.简便、快速
4.纯度要求低
PCR反应结果的检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
常见问题
1.假阴性不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
2.阴性需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。3.假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
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实验所需试剂

货号	试剂名称-(GBCBIO)
R1105	TRNsol/TRIzol RNA提取试剂‍‍
D2105	组织/细胞DNA提取试剂盒‍
D5105	Hpure 植物DNA提取试剂盒
D3105	细菌DNA提取试剂盒
P3711	Long Taq DNA聚合酶
P3511	Taq DNA聚合酶
D2314	dNTP Mix
G3410	电泳缓冲液10 x Tris-MOPS-SDS Running Buffer
T2866	Tris-硼酸-EDTA 缓冲液|5×TBE Buffer
G3470	电泳缓冲液10 x Tris-MES-SDS Running Buffer
G4566	Tris-乙酸-EDTA缓冲液|50XTAE
0288	氯化镁 | Magnesium Chloride, Hexahydrate
M3705	DNA分子标准物DNA Marker IV|DNA Marker IV
G4550	6XDNA上样缓冲液|6XDNA Loading Buffer
P3411	DNA扩增2xPCRmix Master|2xPCRmix Master

队长是我

PCR——实验室必备实验，从基因鉴定到信号通路验证，几乎每周都要 P 个三五次，但是，有多少人能将 RT-PCR、qPCR、Real-time PCR、Real-time RT-PCR 区分开？有多少同学还在犯晕！

本文将从以下几个方面为大家详细的讲解PCR的相关基础知识内容！

• PCR原理
  
• 影响实验结果的关键因素
  
• PCR一般步骤
  
• 不同类型的19种PCR技术：
  
• PCR技术应用
  

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一、PCR原理和历史

PCR，通常指的是普通PCR，以双链DNA为模板，以dNTP为底物，定性扩增双链DNA。
PCR（Polymerase Chain Reaction），中文全称为聚合酶链式反应，是分子生物学研究中最为广泛应用的技术。在70年代的时候首次报道使用聚合酶及合成引物进行单链DNA的扩增，但直到1983年才正式作为一种研究工具用于DNA的扩增。
1983年，美国生物化学家Kary Mullis在深夜开车回家时，突然有了灵感。他在一张收据的背面写下了最终使他在1993年获得诺贝尔化学奖的想法。这个概念很简单：在实验室的试管中复制在细胞中发生的DNA复制过程。其结果是一样的：在现有的基础上产生新的互补DNA（cDNA）链。

二、标准PCR实验原理

PCR用于从被称为模板DNA的起始材料复杂混合物中扩增出一个特定的DNA片段。样品制备和纯化方案取决于起始材料，包括样品基质和目标DNA的可及性。通常情况下，需要将DNA提纯到它的最小扩增浓度。然而，PCR确实需要了解待扩增DNA片段（称为目标DNA）侧面的DNA序列信息。
从实用的角度来看，PCR实验相对简单，可以在几个小时内完成。
影响PCR实验结果有5个关键因素：

①待扩增DNA：也叫PCR模板或模板DNA。这种DNA可以是任何来源的，如基因组DNA（gDNA）、cDNA和质粒DNA。
②DNA聚合酶：所有PCR反应都需要一种能在高温下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是常用的一种，它能在70℃下以60个碱基/秒的速度结合核苷酸，并能扩增长达5kb的模板，因此它适用于标准的PCR，没有特殊要求。新一代的聚合酶正在被设计来改善反应性能。例如，有些聚合酶被设计成只在高温下激活，以减少反应开始时的非特异性扩增。其他的聚合酶则具有“校对”功能，例如，在克隆过程中，扩增序列与模板序列完全一致时，这种功能是非常重要的。
③引物：DNA聚合酶需要一个简短的核苷酸序列来指示它们需要启动扩增的位置。在PCR中，这些序列被称为引物，是单链DNA的短片段（大约15 ~ 30个碱基）。在设计PCR实验时，研究人员要确定要扩增的DNA区域，并设计一对引物，一个在正向链上，一个在反向链上，专门针对目标区域的侧翼。
引物设计是PCR实验的一个关键部分，应谨慎进行。引物序列的选择必须以感兴趣的独特DNA为目标，避免与类似序列结合的可能性。它们应该有相似的熔解温度，因为退火步骤对两条链来说是同时发生的。
如何进行引物设计？引物的熔化温度可能受到鸟嘌呤（G）或胞嘧啶（C）与腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）相比所占百分比的影响，较高的GC含量会提高熔化温度。调整引物长度可以帮助在匹配引物对时补偿这一点。避免形成二级结构或引物二聚体的序列也很重要，因为这将降低PCR效率，有许多免费的在线工具可用于帮助设计引物。
④脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTPs）：这些作为合成DNA新链的构件，包括四种基本的DNA核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。dNTPs通常以等摩尔量添加到PCR反应中，以实现最佳的碱基结合。
⑤PCR缓冲液：PCR缓冲液确保在整个PCR反应中保持最佳条件。PCR缓冲液的主要成分包括氯化镁（MgCl2）、tris-HCl和氯化钾（KCl）。氯化镁作为DNA聚合酶的辅助因子，而tris-HCl和氯化钾在反应期间保持稳定的pH值。

PCR的三个标准步骤

PCR可在短时间内将单个DNA扩增得到成千上万个拷贝。其过程主要由3步组成：

• 变性
  PCR的第一步，称为变性，将模板DNA加热到95℃，持续几秒钟，随着两条DNA链之间的氢键迅速断裂而分离。
  
• 退火
  然后将反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50 ~ 65 ℃，然而，确切的最佳温度取决于引物的长度和序列，每套新的引物都必须仔细优化。
  两条DNA链可以在这个温度下重新结合，但大多数不会，因为混合物中含有大量过量的引物，它们在特定的互补位置与模板DNA结合，或退火。一旦退火步骤完成，模板DNA和引物之间将形成氢键。这个时候，聚合酶已经准备好扩展DNA序列。
  
• 延伸
  

然后将温度提高到混合物中存在的DNA聚合酶理想工作温度，通常在72℃左右，如果是Taq，则为74℃。
DNA聚合酶附着在每个引物的一端，合成新的DNA链，与模板DNA互补。现在我们有四条DNA链，而不是一开始就有的两条。
温度回升到94℃，双链DNA分子，其中包括“原始”分子和新合成的分子，再次变性为单链。这就开始了变性-退火-延伸的第二个循环。在这第二个循环结束时，有8个单链DNA分子。通过重复30次循环，开始时存在的双链DNA分子被转化为超过1.3亿个新的双链分子，每个分子都是由两个引物的退火点划定起始分子区域的副本。
为了确定扩增是否成功，PCR产物可以通过凝胶电泳进行可视化，显示扩增子的存在/不存在、大小和大致丰度。根据应用和研究问题，这可能是一个实验的终点，例如，如果确定一个基因是否存在。否则，PCR产物可能只是更复杂的下游调查（如测序和克隆）的起点。



图1 | 一个PCR循环的步骤

这些步骤中的每一个都被称为循环，重复30 ~ 40次，每个循环的DNA数量翻倍，获得扩增（图2）。



图2 | 通过PCR进行DNA分子扩增的不同阶段和循环

三、不同类型的PCR

由于其多功能性，PCR技术近年来不断发展，导致了多种不同类型的PCR技术的发展。
以下是我们可能会接触或认识到的19种PCR类型。
1、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
Real-time-PCR 和 qPCR 是一码事。实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。
它可以用来确定目标DNA的起始浓度，在许多情况下可以忽略凝胶电泳的需要。这要归功于加入了非特异性的荧光插层染料，如SYBR® Green，它与双链DNA结合后会发出荧光，或DNA寡核苷酸序列特异性的荧光探针，如水解（TaqMan）探针和分子信标。
探针与扩增子内的DNA目标序列特异性结合，并利用福斯特共振能量转移（FRET）的原理，通过一端的荧光分子和另一端的淬灭剂的耦合产生荧光。对于荧光染料和探针来说，随着目标DNA拷贝数的增加，荧光水平也按比例增加，从而可以参照含有已知拷贝数的标准对扩增进行实时定量（图3）。



图3 | qPCR扩增图和标准曲线示例，用于对未知样本的拷贝数进行量化。

qPCR使用配备有荧光检测系统的专用PCR仪，在扩增过程中监测荧光信号。

2、反转录-PCR （RT-PCR）
反转录PCR也叫逆转录PCR。反转录（RT）-PCR和RT-qPCR是两种常用的PCR变体，能够在临床和研究环境中进行基因转录分析和病毒RNA的定量。
RT是用单链模板RNA制作cDNA的过程[3]，因此也被称为第一链cDNA合成。RT-PCR的第一步是在RNA模板和DNA寡核苷酸引物之间合成一个DNA/RNA杂交体。催化这一反应的逆转录酶具有RNase活性，然后降解杂交体的RNA部分。随后，通过逆转录酶的DNA聚合酶活性合成一个单链DNA分子。高纯度和高质量的起始RNA对于成功的RT-PCR是至关重要的。
RT-PCR可以按照两种方法进行：一步RT-PCR和两步RT-PCR。在第一种情况下，RT反应和PCR反应发生在同一试管中，而在两步RT-PCR中，这两个反应是分开的，并依次进行。
注意了，虽然 Real-time PCR（实时荧光定量 PCR）和 reverse transcription PCR（反转录 PCR）看起来都可以缩写为 RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR 特指反转录 PCR，而 Real-time PCR 一般缩写为 qPCR（Quantitative Real-Time PCR）

3、反转录-实时荧光定量PCR（RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法：一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA，然后再将其作为qPCR扩增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行，两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。

4、数字PCR（dPCR）和数字滴定PCR（ddPCR）
数字PCR即三代PCR，是对原始PCR的另一种改进，是一种能够实现核酸绝对定量的精准检测技术，基于泊松分布原理将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元（纳升级）中，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行扩增，从而实现靶标核酸分子的绝对计数，提高检测灵敏度和准确度。
与qPCR一样，dPCR技术使用DNA聚合酶，利用引物组和探针从复杂的样品中扩增目标DNA。不过，主要的区别在于PCR反应的分区和最后的数据采集。
dPCR和ddPCR是基于限制性稀释的概念。PCR反应被分割成大量纳升体积的子反应（分区）。PCR扩增是在每个液滴内进行的。在PCR之后，用泊松统计学对每个液滴进行分析，以确定PCR阳性液滴在原始样品中的百分比。
一些分区可能包含一个或多个目标拷贝，而其他分区可能不包含目标序列。因此，分区分类为阳性（检测到目标）或阴性（未检测到目标），为数字输出格式提供基础。
ddPCR是最近的一项技术，在2011年开始使用。ddPCR利用水油乳剂形成分隔模板DNA分子的分区。这些液滴基本上充当独立的试管，PCR反应就在其中进行。

5、微流控PCR
带有微通道和微室的微流控处理系统最近的发展为一系列的实际应用铺平了道路，包括在微流控芯片上通过PCR扩增DNA。
在芯片上进行的PCR得益于微流控技术在速度、灵敏度和试剂低消耗方面的优势。这些特点使微流控PCR对POCT特别有吸引力，例如，用于诊断应用。从实用的角度来看，样品流经一个微流控通道，反复通过反映PCR不同步骤的三个温度区。10 μL的样品进行20个PCR循环只需要90秒[6]。随后的分析可以很容易地在片外进行。

6、降落PCR(touchdown PCR)
降落PCR，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。
因此，前面几个循环的起始退火温度设定为比引物的最高熔解温度（Tm）再高几度。前几循环温度逐渐下降至设定的最终Tm。通过较高温度获得特异性匹配较高的模板后，再以较低温度高效率扩增。

7、巢式 PCR（nested PCR）
巢式 PCR，先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。巢式PCR是常规PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。
巢式 PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加 DNA 扩增的特异性。在第一次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式 PCR 在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。



8、高GC含量PCR
具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。
为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加剂或辅助溶剂来帮助DNA变性。然而，这些试剂通常会降低引物的 Tm，所以退火温度也需进行相应的调整。
高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增。

9、等位基因特异性PCR（AS-PCR）
等位基因特异性PCR（ allele specific PCR，AS-PCR ），是指利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分（等位基因区分）的目的。
由于PCR过程中引物延伸是3'端开始的，所以3'末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。如果这个碱基与模板互补，则引物能不间断延伸，PCR可以正常进行，得到特定长度扩增带，反之，则不能延伸。所以只要将与正常等位基因所不同的那个突变碱基安排在引物3'最末端，当用某一含突变序列的引物进行PCR时，如果得到特异条带，表明被测基因含有该种突变。没有特异扩增带出现，则表示没有这种突变。
注意：这里由于仅仅利用了引物3'末尾碱基的错配，因此需要摸索一个合适的Tm，才能达到检测目的。

10、多重 PCR（Multiplex-PCR）
多重 PCR，指在一个 PCR 管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重 PCR 检测引起遗传疾病的基因突变时，可以同时扩增 6 个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重 PCR 基础上发展的 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重连接探针扩增技术) 使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重 PCR 耗时的优化步骤。

11、不对称 PCR（Asymmetric PCR）
不对称 PCR，可选择性的扩增出靶 DNA的一条链，从而用于测序反应或制备单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的限制引物的量要合适，引物量过多，则产物主要是双链 DNA；引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称 PCR 的基础上发展出 Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，线性指数 PCR)，使数量限制的引物比过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。

12、反向 PCR（Inverse PCR）
反向 PCR，允许扩增已知序列侧翼的 DNA 区。首先将靶 DNA 用限制性内切酶进行多轮消化，然后连接被消化的片段构建环状的分子，引物设计成可从序列已知的区域向外侧延伸，结果扩增出环状分子上剩余的序列。

13、锚定PCR(Anchored PCR)
用酶法在一通用引物反转录cDNA 3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。类似RACE。它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

14、原位PCR（in situ PCR）
原位PCR是一种通过在单细胞或组织切片上对特异的核酸序列进行原位扩增、检测定位的新技术。结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。用于外源性基因片段检测、、观察病原体在体内分布规律、内源性基因片段检测、导入基因检测、遗传病基因检测等等。

15、重组PCR（recombinant PCR）
又叫重叠延伸PCR、overlap PCR。是指把两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR法。其基本原理是两个基因片段设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。

16、热启动PCR（hot start PCR）
热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。热启动PCR主要借助一种酶的修饰物（如抗体、亲和配体、适体或化学修饰物）来抑制常温下DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR反应体系配制阶段引物与模板、引物与引物之间的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，而无需牺牲PCR反应的特异性。
当反应体系配制好后，在反应初始加热步骤，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活（图1）。激活时间和温度根据DNA聚合酶及热启动修饰物的不同而有所差别。对于某些聚合酶，激活和预变性合并成了一步。
热启动酶的出现大大提高了PCR扩增的特异性。在点突变、基因工程、基因改造等方面表现尤为突出。

17、快速PCR（Fast PCR）
在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需的时间来完成更快的扩增，而不影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于均有高扩增能力的DNA聚合酶，这种聚合酶在每次结合中可引入更多的核苷酸。

18、直接PCR（Direct PCR）
直接PCR意指直接从样本中扩增目的DNA，而无需核酸纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在独特的缓冲液中裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了PCR实验流程，减少了动手操作的时间，同时可避免纯化步骤中DNA的损失



19、长片段PCR技术（long-PCR）
顾名思义就是进行长片段扩增的技术。此技术主要用于基因组扩增。从几kb到几十kb。此技术对于模板、酶、引物等各方面要求很高。近年来出现许多商品化的长片段扩增酶[1]。

四、PCR的应用

PCR已经成为现代分子生物学中不可缺少的工具，并完全改变了科学研究。该技术还为分子生物学领域以外的人打开了细胞和分子过程的研究，因此也被许多学科的科学家发现了用途。
虽然PCR本身是一种强大的独立技术，但它也被纳入了更广泛的技术，如克隆和测序，作为这些工作流程中一个小而重要的部分。

PCR的研究应用包括：
1、基因表达
PCR可以检查特定时间点上细胞类型、组织和生物体之间基因转录的变化。在这个过程中，RNA从感兴趣的样品中分离出来，并反转录成cDNA。然后，特定基因的原始RNA水平可以从PCR中扩增的cDNA数量中进行量化。

2、基因分型
PCR可以检测特定细胞或生物体的等位基因的序列变化。一个常见的例子是对转基因生物体进行基因分型，如基因敲除和基因敲入小鼠。在这种应用中，引物被设计用来扩增转基因部分（在转基因动物中）或突变部分（在突变动物中）。

3、克隆和诱变
PCR克隆是一种广泛使用的技术，通过PCR扩增的双链DNA片段被插入载体（如gDNA、cDNA、质粒DNA）。例如，这使得创建的细菌菌株的遗传物质被删除或插入。定点诱变也可用于通过克隆引入点突变。这通常采用一种被称为重组PCR的技术，其中重叠的引物被专门设计来纳入碱基替换（图4）。这种技术也可用于创造新的基因融合。



图4 | 描述重组PCR实例的图表

4、测序
PCR可用于富集测序用的模板DNA。推荐用于制备测序模板的PCR类型被称为高保真PCR，能够保持DNA序列的准确性。在Sanger测序中，PCR扩增的片段随后被纯化并在测序反应中运行。在第二代测序（NGS）中，PCR被用于文库制备阶段，通过PCR富集DNA样本以增加起始数量，并用测序适配体标记以实现多重检测。桥式PCR也是第二代NGS测序过程的一个重要部分。

5、甲基化
PCR可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性PCR（MSP）方法中，设计了两个引物对，以区分目标位点的甲基化状态。
首先使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(m5C) 。为了检测甲基化位点，一对引物经设计 带有 鸟嘌呤（G），可与目标序列中的 m5C 配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后，与后续PCR循环中的胸腺嘧啶（T）配对）。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态

6、医学、法医学和应用科学
PCR技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。这些应用要求可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此，所使用的PCR仪和PCR试剂必须符合这些要求和目的。
分子诊断应用包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中，利用 PCR进行人类身份鉴定是通过对独特的短串联重复序列（STR）进行扩增而区分个体的。在农业学中，PCR在食物病原体检测、育种植物基因分型和 GMO测试中具有重要作用。

参考文献
[1]       Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 1976;127(3):1550-57 doi: 10.1128/JB.127.3.1550-1557.1976
[2]       Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985;230(4732):1350 doi: 10.1126/science.2999980
[3]       Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HRH. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics 2005;5(2):209-19 doi: 10.1586/14737159.5.2.209
[4]       Bachman J. Chapter Two - Reverse-Transcription PCR (RT-PCR). In: Lorsch J, ed. Methods in Enzymology: Academic Press, 2013:67-74. doi : 10.1016/B978-0-12-420037-1.00002-6
[5]       Morley AA. Digital PCR: A brief history. Biomol Detect Quantif 2014;1(1):1-2 doi: 10.1016/j.bdq.2014.06.001
[6]       Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports 2017;7(1):2409 doi: 10.1038/s41598-017-02217-x
[7]       Ahrberg CD, Manz A, Chung BG. Polymerase chain reaction in microfluidic devices. Lab on a Chip 2016;16(20):3866-84 doi: 10.1039/C6LC00984K
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VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques 2008;44(5):619-26 doi: 10.2144/000112776

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长长的路

准备好了没有，史上最全PCR知识来了：
PCR 技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)也就是我们通常所称的 PCR 反应，自 1971 年发明以来，已经在医学、微生物学、植物学和动物学等领域得到广泛的应用，特别是 2020 年新冠疫情以来，采用核酸筛查的方法寻找新冠病毒感染人群，可谓是一种快速、适用于大 规模人群的筛查手段，同时被当成阳性病例确诊手段之一，自此 PCR 反应被广大的普通民 众所了解和熟知。众所周知，PCR 反应是测序、分子克隆技术的基础，PCR 技术的发明将 分子生物学技术向前推进了一大步。 生命科学是解决人类重大生命问题的科学，PCR 技术的诞生成为生命科学的生长点， 使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。20 世纪 50 年代，遗传物质脱氧核糖核 酸(DNA，Deoxyribonucleicacid)双螺旋结构的发现，开创了从分子水平研究生命活动的新 纪元。此后，遗传信息由 DNA 通过 RNA(Ribonucleic acid，核糖核酸)传向蛋白质这一“中 心法则”的确立以及遗传密码的破译，为基因工程的诞生提供了理论基础。 随着 PCR 技术的发展，对 PCR 技术的使用从测序和分子克隆，逐渐应用于病毒、细菌、 真菌和物种的鉴别和鉴定。甚至，我国的食品安全国家标准(方法标准)中也引入了 PCR 技术。PCR 技术具有高灵敏性、快速和高通量的特点，目前在疾病诊断、致病微生物鉴定、 物种鉴别等领域得到推广和应用。
PCR 技术发展历程

1953 年 4 月 25 日，沃森(James Dewey Watson)和克里克(Francis Harry Compton Crick) 在《Nature》发表 DNA 双螺旋结构模型，自此开创了分子生物学时代，这一发现也被誉为 20 世纪以来生物学方面最伟大的发现，使生命科学的研究深入到分子层次。从此以后，科 学家一直在探索研究 DNA 的新方法，新技术。1971 年，印裔生物学家科拉纳(Har Gobind Khorana)提出“DNA 体外合成”的设想，即经过 DNA 变性，与合适引物杂交，利用 DNA 聚合酶延伸，不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因。但是当时引物合成技术水平有限，尚未 发现较好稳定性的 DNA 聚合酶，所以科拉纳的设想逐渐被遗忘，当时 DNA 体外扩增技术 并未获得全面推广。1973 年，我国台湾科学家钱嘉韵从黄石公园热泉中的嗜热细菌，海栖 热孢菌(Thermus aquaticus)中分离出耐高温的 Taq DNA 聚合酶，并于 1976 年发表于《细 菌学杂志》(J. Bacteriol)。  
第一代传统 PCR 技术

1983 年 4 月的一个星期五的晚上，美国化学家穆利斯(Kary Banks Mullis)驾车在高速 公路上飞驰，脑海中猛然闪现出 DNA 双链的结构，以及让 DNA 片段不断自我复制的想法。 1984 年 11 月，穆利斯对一 49 个碱基对(bp，base pair)的 DNA 片段进行了 10 个 PCR 循 环的复制扩增，成功完成了第一次 PCR 实验。1985 年，穆利斯阐述了 PCR 技术的基本原理， 即在试管中模拟细胞内 DNA 复制，具体包括提供 DNA 体外合成合适的条件，即模板 DNA、 寡核苷酸引物、4 种核苷酸(dNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate)、DNA 聚合酶，合适 的缓冲液体系，通过 DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。最初，DNA 聚合酶使用的是 大肠杆菌 DNA 聚合酶，该聚合酶不耐热，每次加热变性 DNA 后都要重新补加。1986 年， 穆利斯将钱嘉韵发现的耐高温 Taq DNA 聚合酶应用于 PCR 反应，极大地减化了 PCR 工作 流程。
当时，PCR 实验仍需纯手工操作:设置 3 个不同温度的水浴槽，然后按照高温变性、 退火、延伸的顺序，将 PCR 管浸泡在不同温度水浴槽中，完成 DNA 变性、引物结合和 DNA 合成的 PCR 循环，完成一次 PCR 实验需要几十个循环，十分费时费力。1988 年穆利斯所在 的西特斯(PE-Centus)公司发明了第一台 PCR 自动化循环仪，在耐高温 Taq DNA 聚合酶的 配合下，实现了 PCR 技术的实际应用。1989 年，美国《Science》杂志将 PCR 列为十余项 重大科学发明之首，并将 Taq DNA 聚合酶命名为“年度分子”。1993 年，穆利斯因 PCR 技术被授予诺贝尔化学奖。
第二代定量 PCR 技术

20 世纪 90 年代早期，罗氏(Roche)的科学家团队率先在 PCR 反应体系中加入溴化乙 二胺，将样品置于紫外光下检测 PCR 终点荧光信号，可实现目标基因的定性检测。但这仍 然给科学家们留下了一个问题——如何更容易地量化扩增产物的数量，从而确定他们开始扩 增的 DNA 的数量。定量 PCR(Quantitative PCR, qPCR)的概念被提出来，即在在 PCR 反 应体系中加入荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累积，荧光信号强 度也随之等比例增加，每经过一个循环，报告一个荧光强度信号，当报告荧光信号的数量达 到一定的阈值时，可以测量相对数量的 DNA (PCR 产物)——越早达到阈值，样本的初始量 越多。这种连续的荧光测量是当今 qPCR 技术的基础，又被称为实时荧光定量 PCR(Real-time fluoroscence quantitative PCR, RT-PCR)。
初始的 RT-PCR 通过在 PCR 反应中使用能够与 DNA 结合的荧光染料，如 SYBR GREEN 染料，来实现对 PCR 过程的实时检测。SYBR GREEN 与双链 DNA(dsDNA)结合力远高 于溴化乙二胺，结合后能够释放很强的荧光信号，提高了 PCR 检测灵敏度，缩短了 PCR 实 验周期。由于 SYBR GREEN 释放的荧光信号强度与 PCR 产物数量成正比，可通过 Ct 值和 标准曲线对样品中的 DNA(或 cDNA)的起始浓度进行准确定量。20 多年来，以 SYBR GREEN 等荧光染料为基础的 RT-PCR 方法仍然是基础科学研究中最流行的选择之一，但仍 有一些问题，包括产物特异性和扩增目标的信号的不确定性。DNA 结合染料与所有双链 DNA 结合，无法区分非特异性引物退火或伪引物二聚体所产生的多个产品。为了弥补荧光染料的 缺点，在 PCR 反应中，引入了第三个寡核苷酸序列，即探针(Probe)，其上面标记了荧光 修饰基团，与目标序列特异性结合后，可在特定波长的激发光下释放出荧光信号，信号强度 与目标 DNA 成正比。由于探针只有与特异性序列结合后才能被激发出荧光信号，与 DNA 荧光染料相比，提高了荧光信号释放的特异性。
2000 年日本学者 Notomi 在《Nucleic Acids Res.》杂志上公开了环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。2009 年，日本荣研化学株式会社(以下 简称“荣研公司”)研制出 H1N1 环介导等温扩增法检测试剂盒，可通过早期快速诊断对防止 该病症的快速蔓延起到积极作用。目前，LAMP 技术具有高特异性、高灵敏度，操作简单、 对仪器设备要求低等优势，扩增结果可通过观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，已被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速检测。
第三代数字 PCR 技术

1999 年肿瘤基因组学专家福格尔斯泰因(Bert Vogelstein)和金兹勒(Kenneth W Kinzler) 首次在美国科学院院刊 PNAS 上提出“第三代 PCR”数字 PCR(Digital PCR, dPCR)的概念， 通过将样本分充分稀释，分配到不同的 PCR 反应单元，每个单元包含≤1 个拷贝的 DNA/RNA 模板，每个反应单元内均单独进行 PCR 扩增反应，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号 进行统计学分析，以实现 DNA/RNA 绝对定量及稀有等位基因的检测。福格尔斯泰因和金 兹勒将该项技术应用于研究肿瘤罕见突变研究，并于 2003 年进一步提出基于小珠(Bead)、 乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic)的 BEAMing 技术，将 dPCR 技术和流式技术进行结合，应用乳状液实现单个试管中实现 PCR 反应体系的分隔。
随着微流控芯片、油包水乳化液滴和纳米制造技术的发展， dPCR 的基本方法已经逐 渐建立。根据反应单元的不同分隔形式，形成了微反应室/孔板 dPCR(Chamber Digital PCR, cdPCR)、微流体 dPCR(Microfluidic Digital PCR，mdPCR)(大规模集成微流控芯片)和微 滴式 dPCR(Droplet DigitalPCR，ddPCR)三大体系。2006 年，Fluidigm 公司推出了第一台 商业化的基于芯片的商品化数字 PCR 系统——IFC 平台。该平台使用物理矩阵的策略，可 将 48 个样品逐个分布在 770 个微反应单元中。2013 年，Life technologies 推出 QuantStudio3D 数字 PCR 系统，采用高密度纳升流控芯片技术，将样本均匀分配至 20000 个单独的反应孔 中。BioRad 公司采用油包水乳化微滴技术，借助微滴发生器，将样品均分成数万个微液滴。 截至目前，美国 Thermo-Fisher 的 QuantStudio 3D 系统(cdPCR)和 Bio-Rad 的 QX200 系统 (ddPCR)占据了 dPCR 的绝大多数市场份额。  
此外还有
各种PCR技术的介绍：

实时荧光PCR环介导等温扩增(LAMP)数字PCR原位PCR以及
最新PCR技术进展

其他PCR技术进展此外我还整理了
PCR实验室其他方面的知识

DNA(RNA)模板的提取和准备PCR仪校准溯源PCR 实验室的建设及质控常见问题及解答等等内容。
实在太多放不下，大家可以点个关注加个收藏慢慢品尝~~~

感恩由您

标签：引物设计 pcr扩增
PCR实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。其实验方法如下：
试剂准备：
PCR常用的试剂主要包括 DNA 模板、引物、ddH 2 O、 DNA 聚合酶以及特定的反应缓冲液、dNTP、MgSO 4（可选）和 DMSO（可选）。




pcr步骤

PCR
pcr实验步骤-pcr扩增的原理和步骤
二、PCR实验前的准备
在开始PCR实验之前，必须准备好DNA模板（基因组DNA或逆转录制备的cDNA）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)
1.DNA聚合酶。有许多商业 DNA 聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定 DNA 片段进行 PCR，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的Taq聚合酶。如果要对T-vector连接的片段进行PCR，要注意，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有A-tailing，所以应该选择普通的Taq聚合酶或在PCR实验后添加A-tailing。
2.引物的特异性影响 PCR 成功的概率，良好的引物设计对 PCR 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：
①引物的长度。PCR引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(Tm)。Tm 定义为在此温度下，DNA 双链体的一半将解离成单链 DNA。52-58C 范围内的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量应为 40-60%。
④许多软件可用于引物设计，例如primer5和Oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。




基因扩增

实验室设备_试剂耗材_恒温振荡培养箱_移液器_生物反应器_阿尔法
三、实验步骤：
根据PCR使用说明进行试剂混合预配，并设置 PCR 循环。
简而言之，PCR需要经过以下循环：
1.初始化步骤。这仅对热启动 PCR 必不可少。此步骤将溶液加热至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.变性步骤。DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子。此时进入 PCR 循环。
3.退火步骤。变性后，反应混合物中的 DNA 模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 DNA 组装。
4.伸长步骤。在此步骤中，DNA 聚合酶开始合成 DNA，因此温度应为 DNA 聚合酶的最适温度。一般选择 72°C，但有些酶在 68°C 时效果更好。这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的能力。一般来说，DNA 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。
5. 2~4步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个 PCR 过程使用 30-35 个循环。在 PCR 循环的早期，PCR 产物以指数速率积累，而在 PCR 循环的后期，随着 dNTPs、引物的减少和 DNA 聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，PCR 速率逐渐下降。
6.最终伸长率。30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下最终延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链DNA。
7.贮存。最终产品可以在 PCR 机器中维持温度在 4-10°C。




核酸检测

实验室设备_试剂耗材_恒温振荡培养箱_移液器_生物反应器_阿尔法

清风寡欲

PCR又称聚合酶链式反应，PCR的过程可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR的三个步骤分别是1.高温变性:利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，；2.低温退火:低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；3.中温延伸:当调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。它需要DNA模板，上下游引物，taqDNA聚合酶，dNTP以及缓冲液(镁离子很重要)，当然还有超纯水。
当然现在实验室做PCR，买的缓冲液里面是直接加好聚合酶和dNTP的，可以直接用。
一般的25微升体系里DNA模板和上下游引物各1微升，PCR MIX12.5微升，ddH2O9.5微升。