流式小白系列 | 一文读懂流式细胞仪！

千姿百态

流式细胞术实验是实验室常见的基础实验，涉及的知识复杂，影响结果的因素众多。新学期马上开学了，很多初入实验室的科研小白们，为了不让自己成为那个真正的小白，快来和我们一起学习起来吧！

流式细胞仪（Flow cytometer）是一种可以快速、准确，并且能够检测快速直线流动状态的单个微粒（通常是细胞），进行自动分析和分选的设备。获得悬浮在液体中的单个细胞的物理和化学方面的特征参数，同时，可以根据预设参数范围把指定的细胞亚群分选出来。流式细胞术应用范围广泛，包括：细胞功能、细胞活性、细胞增殖、细胞凋亡、免疫表型分析、细胞因子检测、细胞内蛋白质检测、细胞周期等。
流式细胞仪三大主要组成部分（图1 所示）：



图1 流式细胞仪三大组成部分

液路系统

流式细胞仪的液路系统主要为实现样本（细胞或微粒）在管路中形成单列移动，通过给鞘液（一种基于盐的缓冲液或水）施加一定的压力进而使样本聚焦成单个细胞，并且在样本到达检测点之前以相同的速度通过检测点，如图2所示，为了达到以上目的，整个液路系统还有其他辅助系统，如图3所示。



图2 液路示意图   



图3 液路系统组成

光路系统

将不同波长的激光照射到样本上，收集发射光信号，再将这些光信号转换成电信号，导入电子系统，如图4所示。



图4 光路系统

在流式细胞仪中，光学系统由激发光（激光器Laser）和收集光（光电倍增管或PMTs和光电二极管）组成，如图5所示。激光器作为重要的组成组件，常根据波长来分，如常见的405nm的紫激光，488nm的蓝激光，640nm的红激光等，不同的激光器发出的激光照射在细胞后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。收集到的光信号包括散射光信号和荧光信号。散射光信号就是常听到的FSC前向散射光、反应细胞的大小，以及SSC侧向散射光、反应细胞的复杂程度。荧光信号是细胞结合了荧光素后被激光激发所产生的信号。



图5 光路系统

在光路系统中滤光片知识点也是必须要了解的，当激光照射后，发射光经由滤光片将特定波长的光信号引至与其想匹配的检测器中，如图6所示。



图6 滤光片示意图

滤光片种类，如图7所示分为
a.      长通滤光片：允许特定波长以上的所有光通过
b.      短通滤光片：允许低于特定波长的所有光通过
c.      带通滤光片：允许特定波长的光通过



图7 滤光片种类

检测器捕获由激发态荧光团和散射激光发射的光子将它们转换成光电流，并传递到电子系统。流式细胞仪可使用多种类型的检测器，最常见的类型是光电二极管和光电倍增管。
a.      光电二极管：当光子撞击光电二极管时，它会将检测器的原子离子化，在二极管的耗竭区域内产生电子，并将其扫向正负电位。光电二极管价格便宜，但是灵敏度较低，通常用于负责处理最明亮的光或信号的通道，如前散射通道
b.     光电倍增管：当光子进入光电倍增管时，它们撞击光电阴极并产生电子，这些电子从倍增电极移动到产生二次电子的倍增电极，使信号放大，如图所示。光电倍增管对于低信号水平更敏感，可以使单个光子的能量放大数百万倍，它们通常用于测量来自细胞的激发态荧光团的荧光以及侧向散射信号，如图8所示。



图8 光电倍增管示意图

电子系统

当光子进入探测器，光子被转化为电子，以电流的形式输出信号，通过模数转换成数字信号，数字信号被传送到电脑，供数据分析，如图9 所示。



图9 电子系统组成

本文对于流式的介绍，希望让实验小白们可以快速了解流式细胞仪，敬请期待我们接下来的流式小白系列，快速进阶为流式科研小能手。


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原创作者 | Yuanyuan Liu  Miltenyi Biotec

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