western blot入门秘籍（图文并茂，一看就懂）

病理医师

开始做western blot有三个月了，从完全不懂到现在，做了大概七、八种蛋白了，算是有些经验和体会了，觉得western并没有之前想的那样困难，只要小心认真做好细节，而抗体质量不差的情况一般还是能成功的，所以想在这里和大家分享一下我对western blot的体会，希望能帮助初学者快速掌握要领，也希望各位高手来一起交流。
SDS-PAGE实验步骤：
(一) 灌胶与电泳
1. 将清洗处理干净的两块玻璃平板叠放底部对齐，固定在灌胶支架上；
2. 首次使用建议检漏：加入双蒸水至小玻板上缘，等待20-30min，评估液面下降情况，如果下降＞5mm建议重新固定，捡漏后倒掉水液并用滤纸吸干（少量残留水液不影响灌胶）；
3. 配胶：根据目标蛋白分子量选择合适的分离胶浓度，按比例加入配胶各成分，注意最后加入AP和TEMED，特别是加入TEMED后应当立即灌胶；
4. 灌胶：分离胶加至小玻板2/3宽处，大约在插入齿梳的下缘以下1cm处（根据漏胶情况可适当多加一点），然后立即加入双蒸水至小玻板边缘，静置30min（夏天可以缩短至20分钟），可见明显的分界线；
加分离胶至这里file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.jpg
水封file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image004.jpg
凝胶后可见明显界线file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image007.jpg
倒掉胶上的双蒸水，用滤纸将残余的水吸干；
加入浓缩胶至小玻板上缘，立即插入上样齿梳，插入时要将齿梳平行插入并避免产生气泡，室温静置30-45min待胶凝；
加入浓缩胶并插入齿梳file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image009.jpg
5. 胶凝后小心拔出齿梳，将胶板从胶架上取下，两块小板相对的固定于电泳槽中，在两块玻板间加入SDS电泳缓冲液至小板上缘5mm处，在电泳槽和玻板间倒入适当的电泳缓冲液；或者也可以直接取下包入薄膜手套放于4℃保存，1-3天内使用；
取下胶板file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image011.jpg
固定于电泳槽中file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image013.jpg
file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image015.jpg
file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image017.jpg
拔出齿梳file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image019.jpg
加入电泳缓冲液file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image021.jpg
6. 加样：使用微量注射器进行加样，一般Marker3- 5ul，样品15-20ul，加样时将针尖伸到加样孔底部，缓慢小心加入；
加样file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image023.jpg
7. 电泳：浓缩胶部分50-80v使样品浓缩成一条窄带，到分离胶可选择100-120v，直至溴酚蓝到达底部停止电泳。
电泳file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image025.jpg
溴酚蓝到底结束电泳 file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image027.jpg
(二) 转膜
1. 取下胶板，小心分开大小玻板，避免牵拉破坏胶，注意防止胶干燥，根据目标蛋白分子量，按照marker切下所需部分；
转膜准备
甲醇 纯水 转膜液file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image001.jpg
小心打开玻板file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image003.jpg
切胶file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image005.jpg
2. 根据切下胶的大小剪同样大小的6张滤纸和一张PVDF膜（注意剪角以标示正反面）；
3. 将PVDF膜在100%甲醇中浸泡约10秒，然后放入蒸馏水漂洗2-3min，再转移至转膜缓冲液中平衡5min，滤纸放入转膜缓冲液中浸泡3-5min；
4. 制作三明治夹心：
阳极+（白色）
海绵
3层滤纸
PVDF膜
SDS凝胶
3层滤纸
海绵
阴极-（黑色）
注意：
层层对齐，不留气泡，膜正胶负
制转膜三明治file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image013.jpg
file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image015.jpg
4. 合上转膜夹，黑色对黑色，白色对红色将转膜夹放入转膜槽中，加满转膜缓冲液，放入冰袋，同色的电极相对连接电源；
合上转膜夹file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image017.jpg
放入转膜槽中黑对黑，白对红file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image019.jpg
file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image021.jpg
电极同色相对file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image023.jpg
5. 转膜槽放入冷水中并放入冰袋，80v恒压电转移约70min（Bio-rad 湿转）；
转膜注意降温file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image025.jpg
6. 取出膜见marker被转上，间接证明蛋白被转上；
7. 将膜放入TBST清洗2次，每次5min，以清洗转膜液。
(三) 抗体孵育
1. 封闭：5-10%脱脂牛奶或5%BSA封闭（抗体说明书上有特殊要求的按说明书执行），室温、摇床约1h，对于抗体特异性较差的可在4℃冰箱孵育过夜，以封闭膜上的的非特异性位点；
2. 洗涤：用TBST漂洗一次约5min；
3. 一抗孵育：用5%脱脂牛奶或5%BSA的TBST稀释一抗（稀释浓度按照说明书适当调节）4℃过夜或室温1h孵育；
4. 洗涤：用TBST缓冲液漂洗，3-4次*10min（摇床、足够缓冲液充分漂洗）；
5. 二抗孵育：用含1%BSA的TBST，1:5000-1：20000稀释二抗，摇床室温孵育1h；
6. 洗涤：同4
7. 注意：
①不能使用有滑石粉的手套；
②防止PVDF膜干燥；
③膜接触胶的一面为正面，用以直接接触抗体；
④孵育抗体前一定要将膜的一条边轻触卫生纸或滤纸以吸去膜上多余的缓冲液，以避免抗体被额外稀释。
(四) 蛋白质的化学发光检测(ECL)
1. ECL发光底物A、B等量混合；
2. 将保鲜膜铺于暗盒内，将膜吸去多余的缓冲液后正面朝上平铺于保鲜膜上；
3. 将混合的ECL发光底物加到膜上，要注意完全充分的覆盖；
4. 用保鲜膜盖住膜，注意不要产生气泡；
5. 将暗盒移至暗室，可用10瓦的红灯照明，将胶片覆盖于膜上，能见到荧光的情况下曝光10-30秒，看不见荧光的可曝光3-5min甚至更长时间；
6. 曝光后将底片浸入显影液中约1min，再浸入清水中5秒，最后浸入定影液中约1-2min充分定影；
7. 清水充分漂洗底片后晾干后存放。
8. 抗体去除：曝光后的膜可以去除抗体重新孵育其他一抗，从而减少电泳转膜的工作量，曝光后膜用纯水清洗2次，每次5min；然后用抗体去除液室温摇床清洗20min；纯水清洗2次，每次5min；TBST清洗1次3min后重新封闭孵育一抗。
注意：
实验过程中必须戴手套，禁止手与X光片和检测试剂直接接触。
所需试剂：
下面介绍一下我实验用到的试剂，觉得比较不是广告，不过希望能给初学者提供一些建议，免得大家在选试剂时无所适从。
1. TBST
先配制10×TBS：NaCl 80g、KCl 2g、Tris碱30g，加800ml双蒸水，调节PH值到7.4，后定容到1L，室温保存；
需要时取一定量的10×TBS，用纯水稀释10倍，按照每100mlTBS 1-2ml的量加入吐温20，混匀充分溶解即为TBST缓冲液，注意TBST要现用现配。
2. 电泳缓冲液
Tris碱3.02g、甘氨酸18.8g、SDS 1g加水定容至1L，确保PH值＞8.0，电泳槽中两玻板间的缓冲液不回收，而玻板外周的缓冲液可以回收再利用。
3. 转膜液
Tris碱5.8g、甘氨酸2.9g、SDS 0.37g加600ml双蒸水，并加入200ml的甲醇，调节PH值至8.3，定容至1L，注意转膜液要现用现配，不回收。
4. 配胶试剂
买的碧云天的SDS-PAGE凝胶试剂盒，说明书上写的有不同蛋白分子量建议的分离胶浓度，按照说明书剂量依此加入各种配胶试剂就行，简单方便。
5. 预染marker
刚开始用的碧云天的单色预染marker，只有六个条带，而且只有12%分离胶才会完全出现6条。后来换了format的彩色预染marker，共有10根条带，价格算下来也差不多。
6. 抗体去除液
买的碧云天的，不贵，清除抗体效果不错，不用加热，简单划算。

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