什么是荧光原位杂交(FISH)？

笑看风云

以下文章转载自微信公众号 聊点学术

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什么是FISH

FISH：采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。



上一代的FISH还是采用的同位素进行标记，现在基本上都是荧光标记了。在此，要感谢J.G.Baunlan这位大神了。
有了FISH，我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA的表达了。FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增，并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究，同时也是临床上诊断肿瘤的利器。

02
FISH的实验要点

网上有很多关于FISH的实验步骤教程，但每个探针盒子的操作可能存在差异。懂了原理，才能以不变应万变。因此，本部分主要是详细讨论实验要点。
FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。
要点：
（1）良好的前期标本制备十分重要，这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。刺激时间过短或过长都会影响实验观察，因此需要耐心摸索作用时间。

（2）蛋白酶K的作用浓度。浓度高了极易影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。石蜡切片一般要达到10-30min，不要超过半小时，一般来说，20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。

（3）探针标记。市售的探针盒子花样繁多，尽量选择大品牌的试剂盒。严格按照其操作步骤和条件进行。不同厂家的盒子中使用的酶存在差异，因此这一步操作需要根据实际情况操作。

（4）杂交液滴到组织上后不要暴力掀开盖玻片，而是在漂洗的时候采用滴管在其侧面滴洗，轻轻冲下盖玻片。这一步是很有必要的！而在封片时，一定要密封好玻片，可以采用凝胶类的物质封住四周。

（5）杂交条件一般是37℃避光湿盒过夜。至少温度要严格控制在37-40℃，过高或者过低都是不适合的。孵育时间也不要无限延长，一般18-20h就肯定够了，时间过久会造成自动解链，造成信号降低。

（6）漂洗液的温度控制。很多人都觉得这个无所谓。小编个人认为FISH实验是一个对温度非常敏感的实验。保证漂洗液温度为37℃而不是室温，可能对于整个实验有比较良好的影响。

（7）封片后标本要尽快检测和观察。每一次荧光显微镜的观察都会淬灭一部分信号，因此一定要快速观察和采集图像。有条件的话，小编推荐大家尽量选用共聚焦显微镜采集图像，荧光显微镜备选。




此外，老生常谈的就是严防整个实验过程中的酶污染问题，玻片、手套。实验器材等均要严格灭酶后使用，否则从一开始就出问题了。


03
石蜡切片的FISH要点

实际情况下，并不是每个人都有条件选择冰冻切片进行FISH实验。实际上，石蜡切片也是可以做FISH的，只是其中一些步骤可能需要我们多加注意。
（1）组织固定，采用PH7.2的10%甲醛固定24h是比较适合的，PH很重要。较厚的组织块建议切开后再固定。这一点小编已经反复提过很多次了。良好的固定是所有病理实验的前提。

（2）对于石蜡切片来说，采用蛋白酶K作为消化液是更优的选择。消化条件20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min。胃蛋白酶是极易失活的，失活了就没法充分消化，消化过度又会使细胞核变模糊。综合来看，小编更推荐蛋白酶K。

（3）石蜡切片的杂交温度一般都是37摄氏度。而杂交时间则需要摸索才能得到最佳时间。不过，一般的过夜孵育基本可以达到目的。

（4）FISH实验中非特异性着色是个难以避免的问题，我们能做的就是尽量减少背景。具体可作为的地方：充分严格漂洗、全程避免干片、探针浓度不宜太高、杂交温度要控制在37℃。


04
原位杂交与免疫组化的结合

这是一项难度较高的操作，如果你所在的实验室没有相应的SOP指导就更难了。

一般情况下，相对于蛋白来说，DNA和RNA都是比较脆弱的。因此首先应该先完成FISH，然后再开展免疫组化。

小编在此推荐一个可借鉴的操作流程，供参考。

原位杂交在前。
（1）常规脱蜡入水。
（2）37℃蛋白酶K消化20min，37℃漂洗液充分洗去蛋白酶K。
（3）滴加探针，加盖玻片，避光、湿盒、37℃过夜孵育。
（4）如果试剂盒允许的话，将试剂盒中洗脱液水浴加温至37℃震荡洗脱多余的探针。
（5）加碱性磷酸酶标记的抗体，37℃孵育半小时，洗去抗体后显色。

免疫组化在后。

（1）将显色后确认为阳性的切片充分漂洗。
（2）在PH为6.0的枸橼酸钠溶液中，微波至96℃左右，作用10min。
（3）滴加一抗，37℃湿盒孵育2h。
（4）充分漂洗切片，滴加二抗，室温下孵育40-50min。
（5）DAB显色后，采用PBS中止显色反应。
（6）不要复染核，不然就盖住原位杂交信号了。


所有的耗材、器材均需采用DEPC水浸泡。第一步的杂交之后要充分洗脱，漂洗也要充分，但是漂洗也要尽量温柔，防止脱片。免疫组化的各个漂洗步骤、抗体孵育时间要比平常延长至少1倍的时间。

免疫荧光标记+FISH，这里面更为复杂，小编才疏学浅，溜了溜了。

The end.

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