超全攻略 ！一文理清免疫荧光实验步骤、技巧及疑难问题

幸福侠侣

免疫荧光原理及应用
免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术，主要原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析。
由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，广泛用于科学研究（如测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质）。
随着多重免疫荧光技术的兴起和发展，在临床诊断上的应用也越来越丰富（根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等）。



图1：免疫荧光技术实验原理（间接法）。图片来源J Invest Dermatol. 2013 Jan;133(1):e4.




图2：Confocal 检测U2OS细胞 KRR1 (A4487，KRR1 Rabbit pAb)，β-Actin (AC004: β-actin Mouse mAb)，DAPI 染核。



图3：多重免疫荧光检测乳腺癌组织ER，PR及HER2蛋白表达水平。图片来源：Daniel M Spagnolo, 2016,J Pathol Inform.
上面的案例展示结果显示，通过荧光基团单标或多标，轻松实现蛋白亚细胞定位和丰度可视化分析，文章立马增色不少。

虽然这项技术并不复杂，但很多新手在着手实验时会遇到各种各样的问题，从而不能得到理想的实验结果。ABclonal在长期的实验中有一些经验积累，希望对大家有所帮助。

IF实验流程概览及关键点



图4：免疫荧光步骤包括细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等

➤IF操作步骤
样本前处理-细胞样本

1.洗涤：弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
2.固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
3.洗涤：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟。

➤Tips
◆需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；

◆甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
样本前处理-石蜡切片样本

1.烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；

2.脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3也可以选择梯度浓度乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟；

3.抗原修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。

➤Tips
◆流水清洗时水流不能直接对着切片；
◆操作过程中需一直保持切片处于湿润状态；
◆修复液需完全浸没切片上组织；
◆修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；
◆修复完成后避免快速冷却；
◆修复液可根据实验需求自行选用修复液

样本前处理-冰冻切片样本

1.样本在OCT包埋液中进行速冻（OCT的配方针对Optimal Cutting Temperature进行了优化）；

2.冰冻块固定在组织卡盘（chuck）中，并固定在切片组件上；

3.切片厚度为10-20μm，逐片收集；

4.擦去多余的OCT，用组化笔勾画组织的疏水边界。
➤Tips
◆切片晾干10-15min，以防止切片在后续洗涤步骤中脱片。
➤染色步骤
1.封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；

2.一抗稀释：按照说明书要求，将抗体稀释于抗体稀释液中；

3.一抗孵育：吸走封闭液，加入稀释后的一抗，4℃孵育过夜；

4.复温：将样本置于常温，复温15min

5.洗涤：去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；

6.二抗稀释：按照说明书要求，将抗体稀释于抗体稀释液中；

7.二抗孵育：避光室温1h；

8.洗涤：去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；

9.染核/封片：在样本上滴加DAPI工作液，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像。
➤Tips
◆ 封闭剂选择和二抗种属来源相同的血清，如果是直标一抗选择和一抗种属来源相同；

◆ 封闭时间不易过长，30-60min即可，且封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育即可；

◆一抗孵育4℃过夜比较好，抗原抗体结合会比较充分；

◆ 选择高质量能满足免疫荧光应用和物种要求的一抗和荧光二抗，一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来，再结合自己具体的实验要求进行优化；
◆ 如果涉及到双标染色，切记要将两种蛋白的抗体来源种属区分开，二抗的荧光素也要区分开；
◆ 在洗涤过程中，一要注意动作轻柔，固定后的细胞比较脆弱，如果太过剧烈，很容易把细胞吹洗掉，二是洗涤时间要把握好，每次洗涤5min左右，三是切忌不要干片，防止背景过高；
◆ 细胞免疫荧光最好不封片，新手很容易在最后一步功亏一篑

IF常见问题及解决方案

➤常见问题-对照实验的设计

实验前需要对待检测蛋白信息进行查询，以便于了解靶点蛋白表达情况（是否特异性表达，是否需要条件刺激，表达丰度如何以及亚细胞定位）。

加入合适的对照是非常重要的，它可以帮助确认样品之间的唯一变化是否在实验变量范围内，以及包括抗体在内的试剂是否如预期一样起作用。实验对照包括药物学处理、添加胞外配体来调控信号转导通路，或比较基因表达（Knock-out、siRNA等）不同的细胞。

ABclonal提供Knock-out细胞系及Knock-out细胞裂解液可用作阴性对照及抗体特异性验证。实验对照的设计和引入，有利于出现问题时方便进行原因排查，同时也会使实验结果更加严谨及更有说服力。



图5：通常实验中会加设阴性试剂对照和阳性样本对照。

➤常见问题-细胞密度

细胞密度是整个实验是否能成功的关键点之一。无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，爬片后细胞密度直接影响到后续的荧光拍照效果。镜下细胞太多反而会让图像效果很乱，没有针对性；如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果。

所以一定要根据细胞的生长速率，保证玻片上的细胞以单细胞层生长，细胞密度以达到75%-85%最佳。




图6：细胞密度与染色效果的影响。

➤常见问题-荧光信号弱





➤常见问题-背景高





➤常见问题-非特异性染色





ABclonal免疫荧光研究工具

➤细胞器及亚细胞结构标志物抗体list（节选）








图7：细胞亚显微结构示意图附常见细胞器/亚细胞结构标志物抗体

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