Western Blot 原理及基础应用

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Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。它是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
一、Western Blot 原理

Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
二、Western Blot 操作步骤



三、Western Blot的应用

1.检测材料或药物对某个信号通路上蛋白靶点的影响肝癌是最常见的原发性癌症之一，仍是全球第六大癌症相关死亡原因。多靶点药物，如索拉非尼(SOR)，是肝癌治疗的主要抑制剂；然而较差的水溶性、缺乏选择性和明显的耐药性，使其应用受到限制。上海理工大学李钰皓副教授研究团队用铋基介孔纳米材料(NBOF)负载SOR，然后用聚乙二醇和叶酸偶联物(P-FA)包覆，形成了NBOF@SOR-P-FA纳米载体体系。该系统通过将化疗和放射治疗相结合，实现了显著增强的抗癌效果[1]


鉴于NBOF@SOR-P-FA对肝癌细胞增殖和凋亡有显著的治疗作用，观察增殖相关蛋白的表达是否有相应的变化。PCNA（增殖细胞核抗原），经常被用来检测癌细胞的增殖状态。据报道，Bcl2家族(包括Bcl2、Bclxl和Mcl-1)在细胞凋亡中起抑制作用。Western blotting分析显示，NBOF@SOR-P-FA+X射线组抗增殖和抗凋亡(Bcl2、Bclxl和Mcl-1)蛋白的表达明显低于其他组。综上所述，NBOF@SOR-PFA+X射线可以通过调控增殖和凋亡信号通路影响肝癌细胞的增殖和凋亡。2.研究基因在蛋白水平的表达有机磷阻燃剂(OPFR)的大量使用引起了人们对其不确定性环境风险的忧虑，特别是对人类健康风险的极大关注。暨南大学陆钢副教授研究团队通过人肝细胞(L02)对6种芳基OPFR的筛选、2-乙基己基二苯基磷酸(EHDPP)及其代谢物的RNA测序研究了其潜在的肝毒性机制[2]


Western Blot结果表明，部分hub基因编码的蛋白质与基因表达一致。PGK1、PKM、LDHA、GAPDH显著降低，CHOP、ATF3、cyclin D1显著升高。重要的是，细胞凋亡的关键效应因子PARP，在EHDPP(10 mg/L)处理48小时后明显增加，这意味着EHDPP对L02细胞具有毒性作用且呈剂量依赖关系。3.疾病早期诊断结直肠癌(CRC)是全球第二大癌症相关死亡原因。结直肠癌患者的生存率与诊断阶段有关，早期结直肠癌生存率高于80%而晚期则低于10%。患者血清中肿瘤相关抗原(TAAs)的自身抗体已被广泛证明有助于早期诊断。Rodrigo Barderas研究团队通过液体活检的方法来识别针对CRC的自身抗体的自身抗原靶标，这些自身抗体具有显著的区分CRC患者和健康个体的能力。随后经过生物信息学分析，选择了15个更可能是结直肠癌自身抗原的蛋白质，通过Western Blot和免疫组织化学来评估它们在结直肠癌预后中的作用[3]


使用Western Blot对结直肠癌患者的肿瘤和非肿瘤组织样本进行硝酸纤维素膜的丽春红染色和免疫印迹，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为对照分析了12个潜在的肿瘤相关抗原。与非肿瘤组织样本相比，肿瘤组织样本中分析的12种蛋白质中有8种存在统计学意义上的失调，SERPINB12、HMGCS2和FABP5在肿瘤样本中下调，ACTR3、TGM3、SPDL1、SDF2L1和RAB25上调。有趣的是，当比较结直肠癌不同阶段的蛋白质水平时，12种被分析的蛋白质中有9种在统计学上存在显著差异。SDF2L1、RAB25、PSPH和SPDL1在I期和III期(即早期)表达上调。此外，TGM3和ACTR3在疾病的所有阶段都被观察到上调。相比之下，HMGCS2、FABP5和SERPINB12在疾病的不同阶段从统计上讲是下调的，它们的水平往往随着疾病的进展而降低。
参考文献

1.Zhang G C, Liu J, Yu X N, et al. Bismuth‐Based Mesoporous Nanoball Carrying Sorafenib for Computed Tomography Imaging and Synergetic Chemoradiotherapy of Hepatocellular Carcinoma. Advanced Healthcare Materials, 2020, 9(21): 2000650.
2.Zhu L, Huang X, Li Z, et al. Evaluation of hepatotoxicity induced by 2-ethylhexyldiphenyl phosphate based on transcriptomics and its potential metabolism pathway in human hepatocytes. Journal of Hazardous Materials, 2021, 413: 125281.
3.Montero-Calle A, Aranguren-Abeigon I, Garranzo-Asensio M, et al. Multiplexed biosensing diagnostic platforms detecting autoantibodies to tumor-associated antigens from exosomes released by CRC cells and tissue samples showed high diagnostic ability for colorectal cancer. Engineering, 2021, 7(10): 1393-1412.
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