Western blot 原理和详细操作步骤

幸福侠侣

Western blot 原理



Western blot（也称为蛋白质免疫印迹）是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 来分离指定样品中包含的各种蛋白质，然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上，接下来将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中，未结合的抗体被洗掉，只留下与目标蛋白质结合的抗体，最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。
由于抗体仅与目标蛋白质结合，因此一般只能看到一条清晰的带，条带的粗细对应于蛋白质量。通过分析特定反应的位置和强度，可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。由于凝胶电泳的高分辨率和免疫的强特异性和高灵敏度，Western印迹分析可检测低至1ng的靶蛋白。该方法广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等分子生物学领域。

操作步骤：

1. 准备样品
1）制冰，准备冰盒。
2）配制细胞裂解液：根据细胞数量确定所需裂解液：50ul/六孔板一孔 。
裂解液配方：100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ul PMSF
3）按实验需要准备好细胞：去掉培养基，1×PBS洗3次（去掉培养基中的血清），每个孔（6孔板）加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中，置于冰上20min，振荡混合后，再置冰上10min。
4）12，000g，4℃离心15min，收集上清至另一1.5ml管。
5）取2.5ul样品加22.5ul三蒸水稀释，用于BCA法测蛋白浓度。
6）其余样品加5×Loading Buffer（按2.5mlBuffer/10ml蛋白）用95℃煮10分钟，期间振荡一次。
7）直接上样跑胶或者分装-80°C长期保存。
2. SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1）制备分离胶（5ml/gel）
注：不同的分离胶配方可参见《分子克隆》p1716表A8-9
2）小心注入分离胶，留2 cm左右的空间（制胶架红色边框下缘）给浓缩胶，顶层覆盖去离子水。静置约30分钟。
3）制备浓缩胶（2ml/gel）
4）将浓缩胶注入分离胶上端，注意避免气泡。
5）插入梳子，待浓缩胶凝固（胶与梳子之间有明显的分界，加上分离胶的凝固时间要大于2h），用双蒸水将孔洗净，去除凝胶碎片，然后用滤纸吸干水。
6）将胶放入电泳槽，上下槽均加入1×电泳缓冲液（反复使用不要超过3次）。
7）上样：marker孔中取5ul prestained marker加入适量1×上样Buffer,使得总体积与sample孔一样。Sample上样量一般为15－25μl，先用heating block 95℃煮5-10分钟，期间振荡一次，然后快速离心再上样跑胶；在没有load sample的孔中加入等体积的1×上样Buffer。
8）电泳：开始为恒压60-80V，当跑过浓缩胶后，将电流加大到100-120V，电泳时间根据目标蛋白的大小及marker的位置确定，一般为目标蛋白跑到分离胶的三分之二的位置即可。
3. 膜转移
1) 切胶，按Marker指示和目的条带的位置切胶(注意将胶切角做记号)，将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中15分钟。
2) PVDF膜做好记号后先浸入甲醇中1分钟，再连同4张3mm滤纸和海绵浸入转移缓冲液中15分钟。
3) 制备“夹心饼”：
依次按如下顺序：纤维垫--滤纸—PVDF膜—凝胶—滤纸--纤维垫。
  注意：每加一种物品都要对齐，确保没有气泡。
4) 转膜：转膜时间根据1）确定。
PVDF膜一边接正极（红色），凝胶一边接负极（黑色）。
4. 膜封闭和抗体孵育
1) 转膜以后，用10ml的1×TBS室温洗膜10分钟。
2) 5ml奶粉封闭液室温孵育2h或者4℃平缓摇动过夜。由于奶粉较为难溶，因此要提前至少1h配置。
3) 10ml的TBS/T洗膜3次，每次5分钟。
4) 加入5ml一抗稀释缓冲液（抗体根据说明稀释），室温2 hrs或者4℃平缓摇动过夜，回收一抗，按5ul/ml一抗液加入叠氮钠（可抑制细菌生长）4℃保存（不常用的抗体可-20℃长期保存），可重复使用！
5) 10ml的TBS/T洗膜3次，每次5分钟。
6) 加入二抗（一般为1：2000稀释），室温平缓摇动1h。
7) 10ml的TBS/T洗膜3次，每次5分钟。
5. 显影，定影 （或荧光标记的二抗孵育后，直接扫描荧光）
1) 显色步骤：先铺保鲜膜，在吸水纸上再铺上保鲜膜；分别将水、显影液（颜色变深则不能用）和定影液倒入各自的盘中。2.5ml ECL-A 和2.5ml ECL-B混合,避光。将ECL混合液、膜等拿入暗房。关好门，反锁，拉回布。ECL混合液倒入小盒中，膜用吸水纸稍微吸干放入ECL混合液中室温摇动5min（使得ECL均匀的铺过膜），吸水纸吸干后置于保鲜膜上，膜面朝下包好置于夹子上，剪好X-film（注意手只能拿X-film的边缘）放于膜上，剪角一边为marker(注意：取胶片时要把灯光调到最小，且不要对着灯光，应背着灯光。)，根据条带的亮度来调整曝光时间，一般可先曝光2min，观察条带的深度，再确定最佳的曝光时间。
2) 显影，定影: 取出X-film置于显影液中一定时间后(视目的条带强度与背景而定)，水洗一次再置于定影液中定影5min以上。
（当然，随着时代的进步，现在很多实验室很少用古老的胶片显影定影。用在最后的发光二抗孵育后，直接扫描。这类仪器很多，操作方法看不同实验室的配置）

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