立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索

图文播报

查看: 895|回复: 5

一次PCR荧光法检测实验耗时多久?

[复制链接]
发表于 2024-9-2 10:52 | 显示全部楼层 |阅读模式
回复

使用道具 举报

发表于 2024-9-2 10:59 | 显示全部楼层

qPCR实验时使用透明管,得到的实验结果荧光信号值比较低,曲线被压得很低,坐标轴也不能自适应曲线,显示如下图。





而正常情况如下图,纵坐标的范围是可以随着曲线最大荧光信号值而变化的,并可获得一条漂亮的S曲线。





更换成白管后,问题就迎刃而解了。那么,问题来了,为何做qPCR实验时一定要用白管呢?荧光信号值与哪些因素有关呢?我们一起来学习一下吧~

1
白管PK透明管
PCR管/板常见的有白色和透明两种。在传统PCR实验中,两者在使用效果上没有太大差异,相比较透明管更为方便,因为实验者更容易看清楚试剂加上与否。但在荧光定量PCR实验中,白管的优势就凸显出来了。

优势一:白管管壁支持一致的信号反射,提高qPCR结果的一致性。
qPCR实验的核心数据是Ct值,而荧光信号是Ct值计算的数据来源,所以管内的荧光能否完好地传递至顶部的检测器是至关重要的。

如下图是三种不同透明度的管子,因为透明管四周均是透明的,对于底部试剂激发出来的荧光会散向四面八方,管内的荧光信号只有少量能到达管顶部,最终只有少量信号进入检测器,且管间荧光信号不一致。




图1 白管和透明管内部荧光信号路线图

然而,如图1所示,与其他管材相比,白管管壁不透明,几乎没有信号丢失,且隔绝了样品台污染的荧光信号干扰,减少了相同样本孔间差异。

优势二:白管支持最大限度的信号传输,改进对低拷贝数样本的检测,提高灵敏度。





图2 白管和透明管检测信号对比图

从图2中可以看出,同样试剂量的情况下,到达检测器的信号强度,使用白管明显高于透明管。因此相比于透明管,使用白管可明显提高检测器检测到的信号强度,提高qPCR数据的灵敏度。

优势三:支持更小体系扩增,节约实验成本。

正因为白管有着高灵敏度的特性,使用白管可以采用小体积反应,从而可减少实验试剂量,大大节省成本~




图3 白管扩增结果展示图

国际一线品牌也同样证实白管更适合实时荧光定量实验的结论。





如上图,qPCR使用透明和白色耗材的结果比较:

(A)与透明孔相比,白色孔Ct值更低(灵敏度更高)

(B)白色孔在技术重复中也表现出更高的一致性

在设置实时PCR或qPCR的反应时,与透明耗材相比,更推荐使用白色耗材,以实现灵敏和准确的荧光检测。





Sarstedt






那么荧光定量PCR仪需要采用什么技术才能满足使用白管呢?我们来看一下国际主流品牌的定量PCR仪产品,一探究竟吧~


我们来看一下赛默飞的高端系列Q5和Q7,他们用的是CCD顶部检测的技术方案,再来看一下罗氏的旗舰产品LG480,我们可以看到,他们用的也是CCD顶部检测技术。




顶部CCD检测技术光学部件固定,稳定性好,故障率低,对荧光信号的接收和处理能力强,是定量PCR仪检测技术的大势所趋。





综上所述,在进行qPCR实验时,使用白管和顶部检测技术的qPCR仪,可获得更佳实验结果。

回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-9-2 11:05 | 显示全部楼层
一般上机扩增时间是1.5h左右,加上上样时间(应该一般96孔,因为不可能说一次就做一个样本的检测)大概0.5h,所以全程应该2-3h。
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-9-2 11:10 | 显示全部楼层
最快(急诊,夜班标本少时用):使用快速检测采样管,不需要提取,使用快速检测PCR仪,扩增40分。一次做一个标本,算加样和结果分析时间,总实验时间45分。
正常时间:每次提取96个标本,提取上样20-30分,提取仪运行20-30分,扩增上样5-10分,普通PCR仪扩增90-120分,结果分析10分。一批标本需要2.5-3.5小时。
我们是一小时送一批标本,标本少时会等一等攒96个做一批,标本多时一批做不下就会有标本在下一批做。标本比较多时接收标本花费时间也不可忽略
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-9-2 11:19 | 显示全部楼层
以Takara RT试剂盒和定量试剂盒为例,从你rna反转到出结果:
1、配制去gDNA 试剂,于室温或者42度2-5 min(参考说明书);
2、 配制RT试剂 加入去gDNA后的试剂中,37/42度 15 min,85度5 s,然后完成RT;
1、2两步花费半个小时 足以,然后对cDNA进稀释,用于配制qPCR试剂,上机pcr,参考说明书推荐体系和扩增分步操作,一般上机需要65min左右就结束,所以硬性实验(机器跑或者酶处理)就需要95min左右,中间加样,试剂配制所用时间,根据你的样本和熟练程度决定咯~
其他方面,如果你从获得样本,到最终出结果,不是这样简单的一个流程,前期还需要检测定量引物是否特异性、Tm温度摸索、cDNA稀释浓度等等,也需要花时间。
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-9-2 11:20 | 显示全部楼层
2个小时左右吧。
纯粹的上机PCR的时间大概一个多小时左右,前面提取核酸和配制反应体系还需要一点时间,总的来说两个多小时可以走完。
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表回复

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

本版积分规则

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

快速回复 返回列表 客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
快速回复返回顶部 返回列表