技术剖析：分子诊断之争：LAMP VS. PCR

千姿百态

来源：知乎
基于核酸扩增的分子诊断是通过引物介导特异性扩增目的基因以检测内源性（遗传或变异）或外源性（病原体）目的基因的存在与否，进而对疾病的诊断和治疗提供信息和决策依据。其主要的应用场景有传染病的诊断，血筛，肿瘤早期辅助诊断，肿瘤的分子分型，遗传病的诊断，产前诊断，组织分型等。其中在传染病的诊断和血筛方面，基于核酸扩增的分子诊断能缩短诊断的“窗口期”，并且可以定量对病原体进行检测。相比于传统的免疫诊断方式而言，有不可替代的优势。
一方面，由于PCR技术的不断成熟，特别是实时荧光定量PCR (qPCR)的出现，使得基于qPCR的分子诊断产品日渐成为主流。这一块有几个明星产品：赛沛（Cepheid）的GeneXpert PCR分析仪，BioFire的filmArray，IQuum的cobas Liat PCR System 以及Atlas Genetics的io。这几个明星产品的孵化公司都无一例外地被全部或部分收购。这里的赛沛在2016年9月被丹纳赫以40亿美元收购；BioFire在2013年9月被生物梅里埃宣布以4.5亿美元收购；IQuum 在2014年4月被罗氏以4.5亿美元收购；英国Atlas Genetics在2016年的年底也被万孚生物以约1.25亿人民币收购了14.95%的股权。竞争激烈和受欢迎程度由此可见一斑。这几款产品也都是基于微流控的分子诊断产品。另外，我国的博晖创新也于2017年发布了一款基于PCR微流控全自动核酸检测系统。



                                                    图1. BioFire的filmArray
另一方面，环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是Notomi等在1998年报道的一种等温核酸扩增技术。该法依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的4条引物（2条外引物和2条内引物）和一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）。LAMP检测体系中基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在30～60min扩增10^9～10^10倍，特异性较高。LAMP技术的主要原理是DNA在65℃左右可以处于动态平衡状态，DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环。基于这一技术的典型产品是我国的博奥生物的晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪以及百康芯的iChip-400。



                     图2. 博奥生物的晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪
本文将重点比较分子诊断中竞争较为激烈的LAMP和实时荧光定量PCR(qPCR)两种技术的优劣。

1. 仪器成本
LAMP只要一个温度（65度左右），相对于qPCR的三个温度的循环，基于LAMP的扩增仪器的温控更容易实现。所以基于LAMP的仪器更简单更便宜，加热耗能更少。
但是另一方面来看，LAMP的引物设计难度高，试剂成本也相应高于qPCR。


                                            图3. qPCR技术需要三个温度的循环
2. 扩增速度
同样由于LAMP只要一个温度（65度左右），相对于qPCR的三个温度的循环，LAMP扩增不需要反复的升温降温过程，所以基于LAMP的扩增速度快于qPCR的扩增速度。LAMP一般可在30～60min扩增10^9～10^10倍，而qPCR的扩增速度往往取决于扩增仪器加热和冷却的速率。
由于LAMP可以短时间内获得大量的DNA产物，所以可以实现基于浊度的可视化检测。从这个角度上讲，LAMP尤其适用于定性的POCT。
另一方面，LAMP扩增的快速也导致了终产物的浓度高，交叉污染的概率也大大提高，这也是LAMP扩增假阳性高的一大原因。
LAMP扩增因为没有PCR的温区切换过程而显得比较紊乱，也不利于后续的定量。

3. 扩增特异性
由于LAMP技术一般需要相对较长6个引物，而qPCR只用2个引物，在核酸扩增中只有所有的引物序列都匹配才扩增，所以基于LAMP的核算扩增特异性更强。也就是说，同样条件下LAMP的误扩增的概率更低。


                                               图4. LAMP扩增一般需要6个引物
这一方面，笔者并没有找到有效的数据证据。因为扩增的特异性与引物的设计息息相关，所以并不能简单的比较两个技术的扩增的特异性。基于两对引物的巢氏PCR的出现也大大的增强了qPCR特异性，这里最典型的应用实例就是filmArray。


                              图5. 使用两对引物的巢氏PCR技术进一步提高了扩增的特异性
4.        检测的灵敏度
案例1:
Zhibing Lin等人的研究表明使用LAMP和qPCR（real-time PCR）分子诊断技术对于弓形虫DNA的检测极限分别是10fg/ul和1fg/ul。常规PCR，LAMP，qPCR检测284只猪和292羊对应检测出的弓形虫阳性比例为：0.4%，3.2%，4.2%和 3.8%，17.1%，17.8% [1]。

案例2:
Guangxiang Wang等人的研究表明在羊的口疮病毒检测中，LAMP正确识别出46只阳性中的41只（89.13%）; qPCR (real-time PCR)正确识别出了46只阳性中的42只(91.30%) [2]。

案例3：
Yi Tang等人的研究表明在坦布苏病毒的检测中，qPCR和LAMP的DNA检测极限分别为：2copies/ul和20copies/ul；RNA检测极限分别为10fg/tube和100fg/tube。检测出来的概率：qPCR和LAMP：82.6%和79.7% [3]。

案例4：
Chapey E.等人的研究表明，在临床弓形虫检测中，有一个病例qPCR检测出来了，LAMP没有检测出来；LAMP检测出来的qPCR均能检测出来；LAMP还有两个病例不确定，qPCR并没有 [4]。


图6. LAMP和qPCR在临床弓形虫检测中的结果对比
总结：以上四组案例均表明，qPCR的检测灵敏度高于LAMP。也就意味着，同样的条件下，qPCR检测的假阴性概率低于LAMP。

5. 对抑制剂的敏感性

LAMP对样品中抑制剂敏感性低于qPCR，这也就意味着LAMP对扩增环境的要求低于qPCR。

6. 通量

众多周知，在实际的产业化中，分子诊断仪器的通量往往至关重要。对于qPCR而言，由于引物设计的成熟和荧光通道的多样性，往往可以比较好的实现高通量检测。我们所熟知的基于多重PCR的filmArray最高一次可以并行检测二十几个指标。
另一方面，由于LAMP的引物需要4-6个（qPCR两个）且LAMP引物一般较长，LAMP的引物设计难于qPCR（虽然有LAMP引物检索网站的协助，但这个问题依然存在）。引物设计困难也导致了LAMP的检测通量受限。

结语：LAMP虽然很好的解决了PCR的温控难题，但是也相应带来了其他的问题，比如相对于qPCR而言，检测灵敏度不够，引物设计更困难，假阳性高，无法定量检测等。这里面最大的问题还是相对于PCR很成熟的技术体系而言，LAMP目前还需要不断的优化和发展。我

参考文献：
1.        Lin Z, Zhang Y, Zhang H, et al. Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis[J]. Veterinary parasitology, 2012, 185(2): 296-300.
2.        Wang G, Shang Y, Wang Y, et al. Comparison of a loop-mediated isothermal amplification for orf virus withquantitative real-time PCR[J]. Virology journal, 2013, 10(1): 138.
3.        Tang Y, Yeh Y T, Chen H, et al. Comparison of four molecular assays for the detection of Tembusu virus[J]. Avian Pathology, 2015, 44(5): 379-385.
4.        Chapey E. et al. An evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detected Toxoplasma gondii in clinical specimens.

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