实验答疑｜qPCR技术重复的副孔CT值差多少比较合理？

生物科研实验室

qPCR技术重复的副孔是为了避免操作失误带来的数据错误。理论上，如果每一次操作都完全一致，那么CT值的差异理论上会为0，但实际操作中几乎不可能，所以我们追求的是CT值的差异越小越好。那差异应该在什么范围内才属于可以接受的结果呢？一般情况下，一个样本会设置三个复孔，最终该样本会得到3个CT值。此时，使用excel表格内的公式：STDEV(x1,x2,x3)，就可以获得这三个CT值的标准差，也就是SD值，SD小于0.5，则认为是可以接受的实验操作结果。SD越小，代表三个数值之间的差异越小，如果三个数值都一样，那它们的SD值就为0。
此外，复孔CT值的差异大小，除了和操作因素有关，还受其他因素影响。这里，我们挑2个来讲：1 孔间反应的差异。如果使用一些比较老旧的设备进行反应，而复孔刚好落在加热板的边缘位置，那么边缘的孔的反应效率就会和非边缘孔的不一致，进而造成最终的CT值差异。因此，应该尽量避开这种位置进行反应。2 样本质量较差。例如，如果样本cDNA浓度不够高，跑出来的CT值会较大，当CT大于30之后，复孔的SD值会开始变得更大，而理想的CT值范围是25-30之间。关于这一点，NIH有一篇文献是做过相应研究的。感兴趣的同学可以去图中的这个网址查看这篇文献和实验结果。