六种免疫组化抗原修复方法介绍

生物科研实验室

抗原修复是公认的免疫组化比较关键的一个步骤，因为我们多使用福尔马林或多聚甲醛溶液来固定组织。甲醛与蛋白质发生交联反应，覆盖抗原决定簇，极大的影响了我们的实验结果，甚至出现假阴性的现象，下面通过几个问题，带领大家去认识抗原修复。
Q1：
为什么免疫组化要做抗原修复？





A：在免疫组化过程中会对样品材料进行固定，一般常用的就是福尔马林或者多聚甲醛溶液。科学研究已经证明甲醛的醛基与蛋白质发生交联反应，不同程度的遮蔽了抗原表面的抗原决定簇，影响其与抗体结合。其发生交联反应形成的究竟是什么还没有定论，有人说形成的是醛基，有人说形成的是羧甲基。但不管是什么，都会使抗原表面的决定簇减少，影响实验结果，甚至产生假阳性。当然如果使用的是一些其他的固定液（非醛类）就不用抗原修复了。

Q2：
如何获得理想的抗原修复结果？





A：主要有两方面：一是抗原修复方法的选择和修复液的搭配；二是操作人的手法和对实验的理解程度。

总的来说，是个搭配并且需要摸索的过程。需要把握的是抗原修复的实质是选对方法，然后用高压或者微波加热的手段打开甲醛与蛋白质的交联，也就是打开化学键的过程，你只要选对方法，通过温度和时间的改变来控制强度，试验并没有想象的那么难。

Q3：
所有经过甲醛或多聚甲醛固定的组织都要进行抗原修复么？





A：绝大部分用甲醛固定的组织都需要进行抗原修复，但是也有例外。例如："不同抗原修复法对免疫组化HBcAb染色实验"结果恰恰是不修复的切片染色效果最好。推测的原因是HBcAg是乙肝病毒的壳结构蛋白，并非肝组织本身的，因而甲醛并不一定封闭它。相反的是如果你进行高压热修复，反而会让未被封闭的蛋白变性，那实验结果可想而知。（学术就是这么神奇 哈哈！）

Q4：
抗原修复的方法有哪几种？





A：抗原修复的方法主要分为三大类：压力热修复法，微波热修复和酶消化法

压力热修复法

真空负压抗原修复法：

① 切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。

⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的年免疫组化染色方法进行染色。这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。



高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。

⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。
隔水热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。
电炉加热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④ 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。

⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。对各种抗原修复方法的评价。
微波热修复

微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④ 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。

⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

酶消化法

酶消化法:

对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索定。



使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。消化时间和组织固定的长短呈正比。在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应。以高压加热方法、微波加热方法较为稳定,?高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。

Q5：
如何选择抗原修复的方法？





A：我们针对不同的抗原，采取不同的修复方法，取得较理想的染色效果。常用的免疫组化抗原修复主要有微波加热修复法、高温高压修复法和酶消化修复法等方法，抗原修复液主要是枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0）和EDTA缓冲液（pH=8.0 pH=9.0）。

抗原修复的方法选择，我们首先看抗原的定位，是位于细胞膜、细胞质还是细胞核。这三个位置的抗原修复难易程度排序：细胞质抗原>细胞膜抗原>细胞和抗原。


Q6：
免疫组化抗原修复有哪些注意事项？





1、pH的应用范围及选择抗原修复液的pH非常重要，有效的抗原修复pH要比修复液的化学成分更重要，同样的修复液随着pH的升高染色的强度逐渐增强，但最佳pH范围为6.0-10.0。目前大家公认的最好的抗原修复液是pH6.0的柠檬酸盐缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液。作为通用修复液碱性pH的修复液要比酸性的有效，而对固定很长时间旧的存档组织，酸性pH的修复液则优于碱性的修复液。



2、抗原修复时应选择最佳温度70-90℃的温度对未经固定的蛋白质可发生变性，但经福尔马林固定的蛋白质，温度必须达到92℃以上方能使其变性。研究结果显示，温度为92-98℃是合适的，95℃效果最好。



3、抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，绝对不能为了争取时间，强行用冰块或冷水使其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其他的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。



4、尽量使用足量的抗原修复液应用于抗原修复的液体，一定要充足，防止切片干涸。应用大量的抗原修复液时，由于它的量较大，可延缓液体的沸腾时间，增加切片受微波辐射的量，对抗原修复将达到彻底。