石蜡切片的免疫荧光（IF）染色步骤

生物科研实验室

一、实验原理

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）技术是集免疫学、生物化学和显微镜技术于一身的一项常用的免疫标记技术。将荧光物质（最常用的是荧光素）标记于抗原或抗体上，当其与相应抗体或抗原结合后，就会在荧光显微镜下呈现特异性的荧光反应，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、方面快捷等特点。

免疫荧光技术可分为荧光抗原法（用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法）和荧光抗体法（用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法）两种，其中以荧光抗体法最为常用，因此也常将免疫荧光技术称为荧光抗体技术。根据染色方法的不同，免疫荧光技术可分为直接法和间接法两种，前者是直接将目的蛋白与荧光标记的一抗结合的一种方法，后者则是先将目的蛋白与一抗结合后再与荧光标记的二抗结合的一种方法，其中以间接法最为常用。此外，免疫荧光技术亦有细胞免疫荧光（IF-IC）、石蜡切片免疫荧光（IF-F），冰冻切片免疫荧光（IF-P）之分，三者的实验操作大同小异。
二、仪器、耗材及试剂

组织包埋机、组织脱水机、切片机、摊片烤片机、荧光显微镜或共聚焦显微镜、摇床、微波炉、纯水机、粘附载玻片、盖玻片、组织包埋盒、免疫组化笔、抗原修复盒组合式染色缸、湿盒、吸水纸、镊子、毛刷、计时器、乙醇、二甲苯、石蜡、一抗、二抗、PBS缓冲液、柠檬酸盐抗原修复液、DAPI染色液、山羊血清、中性树脂等。



三、实验步骤

1.取材及固定

取材时选取想要观察的部位即可，且要保证材料新鲜，最好在处死动物后立即取材，长时间放置会导至组织蛋白降解或理化性质发生改变，从而影响组织形态。固定的主要目的之一是维持组织原有结构以便观察。可采用4%的多聚甲醛进行固定，一般情况下固定24h左右即可，但也要视组织的类型、大小、固定液的种类等具体而定。



2.脱水

脱水顾名思义就是脱去组织中的水分，其能使组织结构变得更加坚固，以防后期操作造成组织变形或破坏，这是影响石蜡切片质量的关键一步，脱水若不彻底则会影响浸蜡和染色，但若脱水过度则会使组织变脆易碎。通常采用从低浓度到高浓度的梯度酒精进行脱水操作。如：75%酒精4h，85%酒精2h，90%酒精2h，95%酒精1h，无水乙醇Ⅰ0.5h，无水乙醇Ⅱ0.5h。同样，脱水的时间及酒精梯度的设置可先根据经验值进行设定，后续再视实际情况进行轻微调整。



3.透明

透明可按照无水乙醇+二甲苯（1:1）10 min，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min的顺序进行。同样，透明过程并不一定要严格按照上述操作进行，查阅资料就会发现有的地方直接采用二甲苯进行透明，有的则认为二甲苯极易挥发并不适合直接进行透明，所以与无水乙醇混合后再进行透明。此外，无水乙醇与二甲苯的混合比例也是各有不同，有的地方也会为其混合比例设置梯度，如：2/3无水乙醇+1/3二甲苯进行第一次操作，无水乙醇：二甲苯=1:1进行二次操作，1/3无水乙醇+2/3二甲苯进行三次操作等，处理时间上也是各有不同。



4.浸蜡

浸蜡主要是使石蜡进入组织，从而对组织起一定的支撑作用。一般石蜡熔点为56℃~58℃，所以浸蜡温度最好控制在其附近（不同石蜡的熔点略有差异）。为使浸蜡充分，一般也需要操作三次，如：石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各1h。



5.包埋

浸蜡结束后，将组织放入包埋盒中，加入熔化的石蜡，小心将其置于冷台上待其冷却凝固即可（注：取放组织时一定要注意格外小心，以免引起组织变形、折叠或损坏；若为小体积样本则需格外谨慎，以免因失误造成组织丢失；包埋盒的大小也要根据组织的大小和形状进行选择；此外还需注意组织摆放的方位）。



6.切片及展片

切片前，先将蜡块预冷片刻以便于切片。先将切片机调整至较厚的厚度（如：7 μm）进行修片（注：修片后再进行切片时最好换一下刀的位置，刀钝的情况下很容易破坏组织，镜下能看到明显的刀痕），待能看到组织后，将切片机厚度调整至3 μm（石蜡切片常用厚度），以能够切出完整连续的组织片为宜。用毛刷轻轻沾取切好的片子后，先将其置于冷水中进行展片，而后将其转移至42℃左右的温水中进行二次展片，以使组织平整展开，尽可能避免出现褶皱。



7.捞片及烤片

用镊子轻轻拨去多余的组织片，并用报纸或其他较硬的纸轻轻带去水面上的碎片后开始捞片。拿出载玻片，用拇指和食指固定载玻片两侧面，并用中指辅助抵住载玻片背面以固定载玻片（注：分清载玻片正反面，有磨砂面的一面为正面，便于标记，另一面则为反面，是光滑的），将载玻片以大约45°角（视个人习惯而定，不要使组织出现褶皱即可）斜插入水面中，缓缓靠近组织片，待组织片一边接触到载玻片时顺势将载玻片提起即可完成捞片。捞片结束后，将片子置于60℃左右的烤片机上烤片1h即可（注：时间太短可能会脱片，而时间太长也会破坏组织）。至此，石蜡切片制作完毕。



8.脱蜡复水

按照二甲苯Ⅰ（10 min），二甲苯Ⅱ（10 min），二甲苯Ⅲ（10 min），无水乙醇Ⅰ（5 min），无水乙醇Ⅱ（5 min），95%酒精（3 min），90%酒精（3 min），80%酒精（2 min），70%酒精（2 min），蒸馏水Ⅰ（3 min），蒸馏水Ⅱ（3 min）的顺序完成组织的脱蜡复水（注：操作流程并不固定，根据自己的组织适当调整即可）。
9.抗原修复

配制柠檬酸盐抗原修复液（PH6.0），采用微波炉进行抗原修复，首先中高火（80%火力）8 min，然后停火8 min，最后中低火（50%火力）7 min，待其自然冷却后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。



10.封闭

清洗完毕，轻轻吸干水分，用组化笔在组织周围画圈，圈住整个组织，而后滴加山羊血清室温封闭1h，封闭结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。



11.一抗孵育

滴加一抗以覆盖整个组织为宜，4℃，孵育过夜。孵育结束，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。
12.二抗孵育

滴加荧光二抗以覆盖整个组织为宜，放入暗盒内避光室温孵育1h（注：此后所有步骤均需避光操作），孵育结束，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。



13.DAPI染色

采用DAPI染液室温避光染色10 min，用PBS洗涤3次，每次5 min。轻轻蘸干水分，滴加抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片。



14.观察

在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察目的蛋白的分布情况。