细胞株培养过程出现的问题及其预防和处理

生物科研实验室

细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。然而，细胞株在体外培养的过程中会出现一些问题，比如：细胞株无法在培养皿上贴壁生长，细胞株生长缓慢，细胞株死亡等。解决预防处理措施参照如下：

一、细胞株无法在培养器皿上贴壁生长

1.细胞株胰酶消化过度：缩短胰酶消化时间或减少胰酶用量。


2.支原体污染：隔离细胞株，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞株被污染，灭菌处理后丢弃。


3.培养基中无附着因子：如果使用的是无血清配方，应确保含有附着因子或者使用经过包被的培养板。

二、细胞株生长缓慢

1.培养基或血清改变：比较不同培养基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有无差异；通过生长实验比较新老批次血清有无差异；增大细胞株初始接种密度；使细胞株逐步适应新的培养基。


2.必需生长促进成分（如L-谷氨酰胺或生长因子）耗竭、缺乏或分解：去除原培养基，加入新鲜培养基；向培养基中添加生长促进成分（如L-谷氨酰胺）。


3.轻度细菌或真菌污染：在不添加抗生素的条件下进行培养，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。


4.时间存储不当：血清应于-5℃至-20℃下储存；培养基应于2℃~8℃下避光储存；尽量减少血清和培养基见光时间。


5.细胞株初始接种密度低：增大活细胞接种密度。


6.细胞株衰老、老化：将老化细胞丢弃，取用代数较少的细胞。


7.支原体污染：隔离细胞株，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。

三、培养基pH值变化迅速

1.培养箱CO2分压设置错误：根据培养基中NaHCO3的浓度增大或降低培养箱CO2的分压，NaHCO3浓度为2.0-3.7g/L时，应相应地使用5%-10%的CO2分压。


2.细胞培养瓶瓶盖过紧：将瓶盖旋松1/4圈。


3.碳酸氢盐缓存系统缓冲能力不足：加入HEPES缓冲液，使其终浓度为10-25mM。



4.培养基中盐含量不正确：CO2平衡环境中使用以Earle平衡盐为基础的培养基，大气条件下使用以Hanks平衡盐为基础的培养基。


5.细菌、酵母或真菌污染：将细胞和培养基灭菌处理后丢弃。

四、细胞株凋亡

1.培养箱中无CO2：监测培养箱中CO2使用速度以便确定及时更换气瓶；经常检测管路连接处是否漏气；不要频繁开启培养箱门。


2.培养箱内温度有波动：监测培养箱内温度，及时校正。


3.使用抗生素达到毒性浓度：减少抗生素的用量；使用无血清培养基时，抗生素浓度应降低至1/10。


4.细胞株复苏或冻存时受到损伤：取用新的细胞。


5.培养基的渗透压不合适：检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受260~350mOsm/kg的渗透压，加入某些试剂和药物后会影响培养基的渗透压；昆虫细胞培养基的渗透压（340~380mOsm/kg）要高于哺乳动物细胞。


6.培养基中毒性代谢产物蓄积：去除原培养基，换用新鲜培养基。

五、悬浮细胞株集成团

1.存在钙离子和镁离子：用不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液清洗细胞，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。


2.支原体污染：隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。


3.蛋白水解酶消化过度导至细胞裂解、DNA释放：用0.001%DNA酶I处理细胞；用PBS冲洗后再接种到新培养基中。