八种细胞增殖检测方法及选择指南

生物科研实验室

细胞增殖实验，在分子生物实验中非常重要，生物以细胞细胞分裂的方式产生新的细胞，补充体内已经衰老和死亡的细胞，用以维持新陈代谢，同时细胞增殖也是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。
检测细胞增殖的方法目前主要分为直接计数、代谢活性检测、DNA合成检测、细胞增殖相关抗原检测等。此外，还可以检测ATP等酶活性、钙离子内流、细胞膜完整性等，每种检测方法都存在各自的优缺点，应根据不同的实验目的，尽量选择准确性高、重复性好的检测方法或将多种检测方法结合，从而客观、全面地反映实验结果。

一
直接计数法






细胞计数法是一种较简单的检测方法，不需要特殊的试剂和仪器，只需利用血球计数板或细胞计数仪计算得出细胞数目即可。细胞计数法是测定细胞绝对增长数值常用最简便的方法。一般过程为接种21孔/24孔板细胞（如用培养瓶时则21瓶）。分7组，每组3孔（或瓶），培养一周，期间逐日检测一组，计数。把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

优点：简单，省钱！不需要特定的试剂和仪器，准确；

缺点：缺点是无法区分增殖细胞与非增殖细胞，不适合数量较多或特定亚群的细胞计数。

二
检测细胞代谢活性






基于细胞代谢能力还原孵育的底物，使用分光光度计或者酶标仪检测吸光度，从而间接测定活细胞数量，评价细胞的增殖情况。代表方法有MTT、CCK-8、MTS、XTT及SRB法。

MTT法：MTT即噻唑蓝，是一种可接受氢离子的黄色有机化合物,可以被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C等还原为不能溶于水的蓝紫色产物甲臜（formazan）。该产物虽然不溶于水，但可以溶于特定溶剂(如DMSO)，在特定溶剂存在的情况下，该产物被完全溶解，然后通过酶标仪在特定波长（如570nm）条件下根据吸光度来反应细胞增殖/毒性情况。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。
CCK-8法：也有人称该法是MTT法升级版。使用的是WST-8(一种类似于MTT的化合物)，它在电子耦合试剂的作用下可以被活细胞线粒体内的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲臜（Formazan）, 细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
CCK-8法所使用的WST-8检测细胞增殖、细胞毒性的灵敏度比其它四唑盐如MTT, XTT, MTS高，并且对细胞几乎没有毒性, 因此，检测完成后的细胞还可以继续培养使用。

三
活细胞荧光标记






羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上，是一种良好的细胞标记物。
检测法原理：CFSE进入细胞后，可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的。在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。



四
检测细胞DNA合成






通过直接测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力，是检测细胞增殖最准确的方法。细胞在增殖过程中，DNA的倍增，是最显著的变化之一，通过检测DNA量的变化，可判断细胞数量的变化。通过检测DNA进行细胞增殖检测的方法，除了同位素标记DNA外，最常用的就是：BrdU/EdU检测法。常应用于细胞DNA修复，分化及细胞标记物追踪等方面。
MTT法、WST-1法、CCK-8法都是基于细胞活性的细胞增殖检测方法，能检测到细胞的总体增殖效果，但无法检测到单个的增殖细胞。这几种方法尽管都不是检测DNA合成的，但被广泛用于替代[3H]thymidine掺入法。CFDA SE法基于细胞荧光示踪的原理能检测到单个的增殖细胞，但由于每增殖一次荧光减弱一半，在荧光显微镜下较难区分荧光减弱一半的细胞，检测灵敏度不是很高，通常仅适用于流式细胞仪检测。

五
检测ATP含量






ATP是细胞内最重要的能量分子，可以用来衡量细胞新陈代谢水平，死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，ATP与活细胞数目具有良好的线性关系，因此，可通过ATP含量反应活细胞的数目检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。

该方法是通过检测ATP来反映细胞活力的。借助ATP依赖的萤光素酶催化的萤光素发光反应，ATP可以通过测定化学发光来进行定量。由于ATP含量能很好地反映活细胞的数目，而ATP含量和发光强度成正比，这样就可以简单地通过化学发光强度来计算出细胞活力或细胞数目。