qPCR的内参基因有什么用？

生物科研实验室

内参基因的表达水平在不同样本间相对稳定，因此可以用来标准化样本，校正实验数据，消除实验中因上样量不同，操作不同等实验操作产生的误差，确保实验结果的准确性。
让我们透过一个实验案例来探究内参基因与相对定量分析之间的联系。

  评估肝癌细胞中A基因的表达量与正常肝细胞的相对变化。通过荧光定量检测，我们得知：肝癌细胞的A基因CT值为25，而正常肝细胞的A基因CT值为26。据此，利用表达量倍数的计算公式图片，我们得出肝癌细胞的A基因表达量比正常肝细胞高。

  然而，这一结论的成立需要满足几个条件：两组细胞的细胞数量完全相同；RNA提取、逆转录和qPCR扩增的效率完全一致；不存在任何操作误差。这些条件在实际操作中是难以完全满足的。

  因此，为了实现样本处理的标准化，我们引入内参基因进行校正。根据对内参基因特性的了解，我们知道内参基因在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达量是相对恒定的，因此可以用来校正细胞上样量、上样过程中的误差以及实验过程中的误差。让我们再来看看引入内参基因后A基因表达量的计算结果。

  肝癌细胞的A基因CT值为25，内参基因CT值为20；正常肝细胞的A基因CT值为26，内参基因CT值为22。通过内参校正后，我们发现肝癌细胞中的A基因表达量实际上比正常细胞表达量低（计算公式图片）。

   由此可见，为了准确检测特定基因的相对表达水平，选择内参基因进行归一化处理是至关重要的。

内参如何选择可以参阅文献，

常用的QPCR内参基因包括但不限于以下几种:

GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶): 这是一种广泛存在于多种细胞中的酶，参与糖酵解过程，经常被用作内参基因。

β-actin: 肌动蛋白的一种，存在于所有真核细胞中，因其在多种组织中表达相对稳定而被广泛用作内参。

18S rRNA 和 28S rRNA: 核糖体RNA，由于它们在细胞中的高丰度和相对稳定的表达，常被用作内参基因。

B2M (β2-微球蛋白): 在多种细胞中表达稳定，常用作内参基因。

HPRT (次黄嘌呤磷酸核糖转移酶): 参与嘌呤代谢，其表达在多种组织中相对稳定。

TBP (TATA结合蛋白): 参与转录调控，其表达在一些研究中被认为相对稳定。

UBC (泛素C): 参与蛋白质的降解过程，有时用作内参基因。

  综合分析，我们可以得出结论，在相对定量检测中，选择一个恰当的内参基因至关重要；而在选择内参基因时，最关键的因素是该基因在不同实验条件下表达的一致性。确保所选内参基因的稳定性，是实现相对定量分析成功的第一步！