实验干货-细胞复苏要点

生物科研实验室

平时研究用的细胞，有需要冷冻保存。冷冻的过程称为冻存，和冻存对应的过程，称为复苏，通俗地说就是把冻上的细胞化开。



细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好。
细胞复苏的基本原则


快速融化：细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。



在复苏时，需要快速升温，在 1-2 min 内融化并稀释，这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶，也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中，从而避免细胞损伤，提高细胞存活率。



避免温度变化：在复苏过程中，应尽量避免温度的剧烈变化，以免对细胞造成额外的压力。
细胞复苏的实验步骤及注意事项


（1）提前从液氮罐中取出需要解冻的冻存管，放于-80 ℃冰箱（为了避免解冻时冻存管中的气温急剧上升，温差过大导至的爆炸），让冻存管中的液氮挥发。

注意：从液氮中冻存细胞时，要佩戴护目镜和防冻手套，谨防冻伤及冻存管爆炸！

（2）冻存管取出后，以最快速度放入37℃恒温水浴锅中。如果储存装置和解冻装置相隔较远，可使用装有干冰的隔热容器临时保存和运送细胞。



细胞放入水浴中复苏时，注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以可以避免复苏过程中细胞液中有冰晶的出现。快速升温可以使冰晶迅速融化，避免伤害细胞，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。



另外，冻存管管口不能接触到水浴锅里的液体，避免造成污染。水浴锅中的无菌水也要定期更换。

什么时候停止解冻？



通常建议冻存管融化至只剩约2毫米直径的冰晶时，即可停止水浴，继续晃动至冰晶融化。此时复苏的时间刚好，避免复苏过头。（升温至室温或更高温度会增加冷冻保护剂的细胞毒性，这会极大影响细胞活力。）

（3）完全融化后，马上擦干并用75％酒精擦拭冷冻管外部进行消毒。然后在无菌环境下，用移液管吸取5ml预热的完全培养基加入15mL无菌离心管中，再吸取冻存管里的细胞悬液加入离心管中。

注意：



◆ 解冻后应尽快稀释，以减少 DMSO 的细胞毒性。



◆ 此时细胞比较脆弱，细胞膜表面还未完全恢复，剧烈的吹打会造成细胞活率下降。因此，需要以轻柔的方式稀释细胞冻存悬液。轻柔颠倒混匀，充分稀释冻存液，有条件可以静置1分钟，使细胞恢复渗透压，再进行下一步操作。

（4）根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，吸掉上清液，加入2-3mL预热的完全培养基，用移液管轻轻吹打均匀，保证细胞完全重悬。

注意：离心的目的有两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程。但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转速不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转速过高活细胞受压过大，会导至死亡。推荐250 g离心4 min。

（5）吹打好后，用完全培养基适当稀释，然后将重悬的细胞全部移入新的培养皿或者培养瓶中摇晃均匀。



（6）最后放入37℃恒温细胞培养箱，依据细胞状态，在细胞贴壁后或 24 h 后，更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。

注意：细胞复苏的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
常见的问题


（1）细胞复苏后，细胞数量很少

可能得原因：细胞冻存前活细胞少，状态不佳；细胞解冻速度过慢；细胞冻存悬液在常温下时间太久；未充分稀释冻存液；离心速度不恰当。

对策：



◆ 确保冻存前细胞状态良好，活细胞比例高。



◆ 加快解冻速度，尽量减少在常温下的放置时间。



◆ 确保冻存液充分稀释，避免对细胞造成损伤。



◆ 调整离心速度，找到最适合细胞的离心条件。



（2）细胞复苏后，很多难以贴壁

对策：



◆ 检查缓冻快融操作是否规范，避免操作不当导至的损伤。



◆ 确认冻存前细胞的密度和活率是否适宜。



◆ 控制好消化时间，避免过长导至细胞贴壁能力下降。



（3）细胞贴壁了，却长不起来

对策：



◆ 调整细胞密度，尝试将细胞转移到较小的培养器皿中，促进细胞间的相互作用。



◆ 给予细胞足够的时间来适应培养环境，有些细胞复苏后需要一段时间才能开始生长。



◆ 确保冻存前细胞状态良好，避免冻存前细胞已处于凋亡状态。

此外，还需注意培养环境的无菌操作，定期检查培养基的成分和pH值，以及确保足够的营养供给和适宜的气体环境（如CO2浓度）。在处理细胞时，温和操作，避免造成机械损伤。



细胞培养是一门实践性很强的技术，需要在实践中不断学习和总结经验，希望这些建议对您有所帮助。