实验干货：细胞培养实战攻略

生物科研实验室

    细胞是生物细胞学实验的基础，药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。而细胞培养，受人员操作和环境条件的影响比较大，在细胞培养中常常会遇到很多的细节问题，而每个问题都有可能导至细胞培养的失败。我们汇总了细胞实验室多年来的细胞培养经验分享给大家，希望能给大家的细胞培养提供参考。
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细胞系身份需明确
我们之所以选定某种细胞系开展实验，是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性，疾病特性，功能特性，基因表达特性等。一旦用错了细胞株，对我们研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。
而近年来，多个权威机构发现细胞系在培养和流通过程中，出现了很严重的交叉污染。据不完全统计，单就HeLa细胞系导至的污染致使3万多篇论文结果的准确性存在问题，而这种情况不仅仅限于HeLa细胞。多个权威机构研究人员检测发现超过451个细胞系已被其它细胞完全吸收，在所检测细胞中污染占比46%，可见细胞交叉污染的现象非常普遍。因此，做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株，最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。
目前，STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最有效和准确的方法之一，是ATCC等权威机构认定的金标准。不过可惜的是并非所有细胞均可进行STR鉴定，目前只有大部分的人源细胞株和45个种类的小鼠细胞株可以进行鉴定。其他细胞株可以结合细胞形态、特性和物种鉴定来进行确认。
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培养、传代、冻存和复苏
1.准备工作：
根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件，以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。
2.贴壁细胞传代：
1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导至易污染）
2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）
3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另外，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。
4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。
PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。
5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。
6）加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。
7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

3.悬浮细胞传代：
因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。
1）直接传代时，静置5-10分钟，待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培养液，补足新鲜的含血清完全培养液，混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，轻轻摇晃混匀。
2）离心传代时，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。
3）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。
4.贴壁悬浮混合型细胞传代：
先将悬浮的细胞收集，再参考“贴壁细胞传代”方法进行消化收集，一起接种到培养器皿中。
PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高，培养中最好参考指南控制好细胞密度，不能过密也不能过稀。
5.细胞冻存：
1）按照“细胞传代步骤”中的方法收集细胞。
2）加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的完全培养液），使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml，移入细胞冻存管中。
3）程序降温（以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例）：4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导至细胞受损。）
6.细胞复苏：
1）取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（通常2min内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导至冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。
PS：干冰运输的冻存细胞，收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。
2）转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。
3）将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清完全培养液离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清。
4）重新加入经预热的含血清完全培养液重悬细胞，以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。
5）放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。
03
污染防治
1.细菌污染

细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要由操作不慎或使用了灭菌不完全的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。
污染处理：由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥，所以出现污染后加双抗（青霉素&链霉素，Penicillin + Streptomycin）一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周，效果相对还不错。

2. 真菌污染

细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
左边这张是比较典型的霉菌污染的图片，右图是酵母污染，镜下可以看到明显的出芽形态。
污染处理：可用100ug两性霉素B/T25瓶，处理一周。
注：两性霉素毒性较大，需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。
3.支原体污染

支原体的危害：支原体污染可以改变细胞的特性。例如部分支原体会快速消耗培养液中的精氨酸，与细胞竞争营养，从而使细胞的生长速度减慢或停止；同时支原体还可以改变细胞的酶谱、细胞膜成分，造成细胞染色体异常或细胞病理性改变等。上述情况会严重影响到使用这些细胞所做实验的结果，导至结论不可靠。
支原体的预防与清除：由于支原体无法在镜下直接看到，需要通过PCR法等进行检测才发现，出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检，做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检，直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理，优先处理“支原体阴性”细胞，后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。同时，新引进的细胞系都进行支原体检测，确保不给实验室带来新的污染。

4.实验室细胞污染防治

建立良好的规章制度对减少细胞污染会有很大的帮助。包括准入制度、操作规范和日常管理制度。
准入制度：包括了人员的和物料的。人员需要进行培训之后才能自己进行操作，而且要符合穿戴要求才能进实验室，如白大褂、隔离服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品应严格消毒灭菌，而购买的物品需要从正规的、可靠的渠道购买。新买的细胞应检测验证后再使用。
操作规范：对于常规操作最好制定规范，且实验室人员都要按操作规范进行，不能随意更改，同时也是培养实验人员的良好操作习惯。比如，枪头滴管吸完就不再二次伸入培养基中吸取，一次吸够足够量的培养基。加液时也应尽量做到悬空加液，这些都可有效预防支原体污染和细胞交叉污染。另外可以的话，一次只操作一株细胞，细胞与细胞间最好有一点时间间隔，避免交叉污染。
日常管理制度：则包括环境及耗材试剂等的使用、清洁、保养等各方面的规则、方法。还有试剂耗材等的用量、库存及采购等的管理，包括细胞样品的两级库存管理。对于不易发现的污染源，最好定期进行检测，主要是支原体污染和细胞交叉污染。

04
细胞培养常见问题汇总
新买的细胞
1.新买的或惠赠的细胞如何处理？

不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手应赶紧做这几件事：检测瓶子是否破裂；培养基是否漏出，是否浑浊；是否有支原体污染；迅速扩增冻存。

2.能否使用与原先培养条件不同的培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

3.购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？

常见原因可能有：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；培养箱气体浓度达不到要求；细胞置于 –80 ℃ 太久。

复苏冻存的细胞

4.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

5.冷冻管应如何解冻？

将冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。

6.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？

现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO除去，但也有研究者认为除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。