实验总结 | 逆转录常见问题与解决办法

生物科研实验室

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可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？



不可以。逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。



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如何检测RNA逆转录成功与否？



1) 内参法：理论上，逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段，所以电泳条带应该均匀分布在泳道上，如果RNA丰度低，电泳检测也可能无产物，这种情况通过PCR扩增内参基因，如果有扩增产物，cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下：如目的基因片段过长，可能会有例外)。



2) 已知基因扩增法：如果有已知以此模板扩出来的基因，可以用此基因的引物验证。能扩增出内参，不一定就说明cDNA没有问题。因为内参在cDNA中丰度高，容易扩增。如果cDNA因为各种原因导至部分降解，则会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果，而内参因为是高丰度基因，扩增很可能不受影响。



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逆转录产物中存在gDNA对后续qPCR实验有何影响？



当cDNA产物中混有gDNA时，cDNA和gDNA在qPCR反应时会被同时扩增，无法区分荧光信号是来自于cDNA还是gDNA，因此定量结果可能会存在偏差。特别是低表达量的基因，本身的扩增信号低，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影响。在逆转录的时候，加一步gDNA去除的步骤，能够有效降低gDNA污染的影响，增加实验的可信度。



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逆转录时，如何选择逆转录引物？



逆转录引物有三类，分别是oligo（dT）、随机引物（Randomer）和基因特异性引物（Gene-specific primer，GSP）。



1) Oligo（dT）



是一种由T碱基组成的引物，因绝大多数真核细胞的mRNA 3’端具有Poly（A）尾（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有Poly（A）尾），Oligo dT结合在Poly（A）尾上与其配对，从头逆转，得到的cDNA更长更完整，但对 RNA 样品的质量要求较高，少量的降解会使全长cDNA合成量大大减少。当下游实验为普通PCR扩增，需要进行全长第一链 cDNA 合成，且模板为真核生物来源，逆转录反应推荐使用Oligo（dT）；



2) Randomer



即随机六寡核苷酸引物：包含6个碱基的任意组合，可随机结合在RNA链上的任意6个碱基，随机结合到模板RNA的任何区域，能够逆转录更多的RNA，因此得到的cDNA产量更高；尤其在靶RNA序列很长或包含较多二级结构，使用Oligo（dT）不能有效引导cDNA合成时，使用随机引物是较为有效；同时适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源时，逆转录反应推荐使用Randomer ；



3) Gene-specific primer，GSP



结合特定的基因序列，可按要求自行设计合成，与模板序列互补，适用于基因表达量低、序列已知的基因逆转录。一般主要用于一步法RT-PCR反应。



当cDNA后续进行qPCR，建议将随机引物与oligo dT引物结合使用，可以大大提高逆转录效率及后续qPCR的灵敏度，避免3’端和5’端的扩增偏好性。



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逆转录后，RT-(q)PCR扩增量低或未扩增？



1) RNA完整性低

合成cDNA前，通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。

尽量减少RNA样品反复冻融的次数，以防止降解。

遵守实验室的最佳操作惯例，以避免RNase污染。

在建立逆转录反应时加入RNase抑制剂。

使用确认无核酸酶或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保无RNase。

将RNA存储于EDTA缓冲溶液（0.1mM的EDTA，或10mM的Tris+1mM EDTA）中，以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。

在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中，选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。

考虑使用对已降解的RNA样品高度有效的逆转录酶。

2) RNA纯度低

遵循特定来源（组织、血液和植物）样品RNA纯化方案。

通过UV光谱法，读取一定波长范围的吸光度，评估RNA的纯度。

检查RNA提取步骤。避免超过源材料推荐的用量，使样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确，以除去杂质和抑制剂。

如有必要，在无核酸酶水中稀释起始RNA，以降低潜在的抑制剂浓度。

如有必要，重新纯化RNA样品，以除去残留的盐和抑制剂。

考虑使用耐受盐、残留生物抑制剂和提取试剂的抑制效应的逆转录酶。
3) GC含量高或二级结构

在逆转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却。
通过在较高的温度下（例如50℃）进行逆转录以最小化发夹序列形成的可能。

使用能够承受高反应温度的热稳定逆转录酶。
4) 低RNA量

检查起始RNA的推荐用量方案。通过紫外光谱确定RNA量。为获得更高精度和特异性，可考虑选择基于荧光定量的方法。

在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中，选择对RNA完整性影响最小的基因组DNA去除方案。
使用高效率、高灵敏度的逆转录酶，以逆转录低丰度RNA。

选择在宽的起始RNA量范围内可获得高度线性的逆转录试剂，以确保可以准确定量低丰度RNA。
5) 不理想的逆转录酶

为了提高cDNA的得率，选择具有更高灵敏度、持续合成能力、和耐受抑制剂的高效逆转录酶。高效逆转录酶非常适合于具有挑战性的RNA样品，如已降解或含抑制剂的样品。

对于较短反应时间和较高反应温度的实验，分别使用具有高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。
6) 逆转录未达到理想时间和温度

确保反应时间和温度适合于所选的逆转录酶。
7) 不正确的引物设计

针对特定的RNA模板，查看关于逆转录引物类型的建议。例如对于细菌RNA或缺乏poly(A)尾的RNA，以及可能降解的RNA，使用随机引物代替寡核苷酸（dT）引物。

对于基因特异性的引物，确保引物的序列与靶序列的3' 端互补。

8) 反应组分的质量（或稳定性）

循制造商的建议存储和使用试剂。

确保使用的试剂为新鲜配制，并适于所选择的逆转录酶。

混合试剂能完全溶解，可能已经沉淀的DTT和盐。