可用于单细胞分析的选择性液滴提取微流控装置

微流控芯片

可用于单细胞分析的选择性液滴提取微流控装置

基于细胞阵列的微流控装置是单细胞分析的强大工具，因为其可被用于从细胞群中分离出单个细胞以进行长时间观察，通过在流道中捕获细胞，微流控装置可以检测包括细胞互作、药物反应和蛋白质表达在内的细胞行为的各个方面。目前，基于重力、流体动力学、光镊和介电泳（DEP）等在内的方法已被应用于微流控装置以实现单细胞的捕获。

此外，许多研究需要在成功捕获细胞后从微流控装置中选择性提取细胞，以便后续对更具体的反应进行片外分析。然而，传统的微流控装置直接在流道中捕获裸细胞，这可能会由于用于捕获的压力或流体中的污染而导至细胞损坏。此外，在单微米尺度上分析如大肠杆菌等在内的样品，需要相应较小的微通道，这使得精密制备可以适配微通道的阀门和电极等用于细胞提取的组件更加困难。

为了克服这些困难，微液滴可以用来保护细胞免受压力和污染，并且液滴的大小可以灵活调整，以便于处理细胞。此外，微液滴还可以通过与细胞阵列相同的方式被捕获在微通道中。然而，目前还没有开发出一种有效的平台，可以在微液滴被捕获后从液滴阵列中选择性提取目标液滴。

据麦姆斯咨询报道，近期，日本早稻田大学（Waseda University）和千叶大学（Chiba University）的研究人员开发了一种微流控装置，能够从基于介电泳的多个液滴捕获袋（droplet-trapping pockets）中选择性提取液滴。该微流控装置由一个主微通道、五个带侧通道的液滴捕获袋和合理配置于捕获袋周围的驱动电极对组成。由于主通道和侧通道之间的流动阻力差异，该微流控装置能够将包封生物样品的琼脂糖液滴成功地捕获到捕获袋中。此外，该微流控装置在500 V的电压下，通过电极对之间产生的介电泳力，可以实现从捕获袋中选择性地提取目标液滴。

微通道采用软光刻技术制备。用SU-8光刻胶（SU-8 3025）制作模具。将聚二甲基硅氧烷（PDMS）和固化剂按10：1（w/w）的比例混合，倒入模具中，热固化，然后从模具中取出，形成微通道。氧化铟锡（ITO）电极是通过光刻和蚀刻工艺制造的。电极设计在涂有 700 nm 厚 ITO 的玻璃基板上使用 AZ 光刻胶 （AZ P4620） 进行图案化，然后使用 15% 盐酸对过量的 ITO 进行湿法蚀刻，并使用丙酮和 2-丙醇去除光刻胶。最后，在等离子体处理（Aiplasma，Matsushita Electric Works，Forest Grove City，OR，USA）后，在显微镜下（IX71，Olympus，Tokyo，Japan）对齐并粘合基板上的微通道和ITO电极。然后将粘接器件在100°C下烘烤30 min，以提高粘接强度。

试剂制备

琼脂糖溶液用于微滴。将琼脂糖和超纯水以1：99（w/w）的比例混合，得到浓度为1wt%的琼脂糖溶液。矿物油被用作载体油。将Span 80以1重量%的浓度作为表面活性剂加入到矿物油中。

细胞制备

以大肠杆菌细胞为模型生物样本。本研究中使用的大肠杆菌菌株 （DH 10B） 具有与 trc 启动子融合的无启动子 gfp 基因的转录融合。我们在37°C振荡下在补充有0.1mM异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的Luria-Bertani（LB）肉汤（Difco）中培养细胞。为了制备大肠杆菌细胞以包裹在液滴内，将大肠杆菌细胞甘油储备液的等分试样（2μL）接种到LB培养基（2mL）中，并在37°C下振荡孵育15小时。用液化琼脂糖凝胶将细胞培养物稀释至 OD 600 值 0.03。

琼脂糖液滴制备

包裹大肠杆菌或荧光微珠的琼脂糖液滴在引入微流体装置前不久制备。将含有大肠杆菌或荧光微珠和矿物油的琼脂糖溶液引入微流控装置中以产生液滴。图3显示了使用微流控装置产生液滴的示意图和显微镜图像。然后收集液滴，并在4°C下静置1小时，使其完全凝胶化。

实验装置

琼脂糖凝胶液滴和矿物油通过注射器（1750 CX，Hamilton，Reno，NV，USA）引入设备，由注射泵（Legato 100，KD Scientific，Holliston，MA，USA）驱动。直流电压/电流源（6166，ADCMT）用于在电极对之间施加电压。在这种情况下，阳极和阴极分别连接到上游和下游电极。使用显微镜（IX71，奥林巴斯，东京，日本）和高速相机（FASTCAM Mini AX，Photron，东京，日本）观察实验结果。

精确的液滴提取需要优化的电场分布。使用 COMSOL Multiphysics 5.4 进行有限元仿真，以研究器件中的电场分布。

仿真使用了具有三个口袋和三个电极对的模型。微液滴（琼脂糖液滴）的相对介电常数设置为78，液滴周围的液体介质（油）的相对介电常数设置为2.5，通道壁（PDMS通道壁）的相对介电常数设置为2.75，电极（ITO）的相对介电常数设置为1。利用AC/DC模块的静电接口模拟了通道中电场梯度的分布，并在模型中心的电极对上施加了500 V的直流电压。使用的网格是物理控制的网格，尺寸更细。图 4 显示了施加电压时 t 时间的仿真结果。一次只激活一对电极;因此，其他捕获袋没有暴露在电场中（图4B）。该结果表明，当施加电压时，DEP应该只发生在相应的液滴上。此外，施加电压的电极对尖端的电场最强。因此，液滴所经历的介电泳力（FDEP）可以认为发生在图4C所示的方向上。由于在下电极方向上产生的FDEP被捕获结构阻挡，因此可以预期液滴沿上电极方向移动。仿真结果还表明，液滴暴露在电场中，液滴内的细胞可能会受到电压的影响。一些研究报告称，应用DEP会对细胞造成压力[27,28]。Desai等[29]研究了DEP对NIH3T3成纤维细胞的影响，并报道了随着场电压和暴露时间的增加，细胞应力增加。因此，本研究应调查提取过程对液滴内细胞的影响。

研究人员首先对该微流控装置的液滴捕获和提取性能进行了验证。图3显示了直径为30 μm ~ 55 μm不等的四种液滴的捕获和提取过程。在成功捕获液滴后，对电极对连续施加电压以产生正介电泳（P-DEP）并实现液滴的提取。未被捕获的液滴可能会再次被捕获在更下游的开放捕获袋中。当这种情况发生时，有必要通过向下游捕获袋对应的电极对施加电压来重新提取液滴。总体而言，相关实验结果表明，该研究所制造的微流控装置能够捕获和提取各种尺寸的液滴。

随后，研究人员进一步评估了该微流控装置选择性液滴提取的能力。在该研究中，研究人员使用琼脂糖液滴包裹直径为3 μm的荧光微珠，并从微流控装置入口处以0.2 μL/min的流速向微通道中注入包裹荧光微珠的琼脂糖液滴和矿物油，以实现液滴的捕获。如图4所示，所捕获的液滴中，位于左捕获袋中的液滴含有一个荧光微珠，而位于右捕获袋中的液滴内是空的。

当对左捕获袋对应的电极对施加500 V电压时，只有位于左捕获袋中的液滴被成功提取出来。这些结果表明，正介电泳只发生在对电极对施加电压的捕获袋中，从而证实了选择性液滴提取的可行性。

接下来，研究人员通过测试使用细胞进行可重复实验的能力，验证了该微流控装置的生物效用。图5显示了包裹大肠杆菌细胞的琼脂糖液滴的捕获和提取。从微流控装置入口以0.2 μ L/min的流速向微通道中注入包裹大肠杆菌细胞的琼脂糖液滴和矿物油，结果液滴被成功捕获在捕获袋中。在相应的电极对上施加500 V电压后，电极对之间产生了足够的正介电泳，实现了液滴的提取。结果表明，该微流控装置能有效够捕获和提取包裹细菌和其他生物分子的液滴，具有良好的生物效用。

最后，为了评估提取过程是否破坏了液滴中的大肠杆菌细胞，研究人员比较了施加电压的液滴（DEP液滴）和未施加电压的液滴（对照液滴）内细胞的特定生长速率。结果表明，该研究中使用的提取工艺对大肠杆菌的生存能力没有显著影响。

综上所述，在该研究工作中，研究人员开发了一种简单的新型微流控装置，用于液滴的捕获和低损伤选择性提取。相关实验结果表明，该微流控装置能够有效捕获和选择性提取液滴，并且提取过程对细胞活力没有显著影响。因此，该研究的结果将有助于基于液滴的单细胞分析的进一步发展。

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