蛋白纯化过程中的七大常见问题详解

xiaoqin

重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构，研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质，然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。在蛋白纯化的过程中，我们可能会遇到一些问题。让我们一起来看看这些问题，并探讨相应的解决方案吧！

蛋白纯化过程中的七大常见问题详解：

1. 通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？

①若纯化的是上清液，蛋白酶可能会对目的蛋白产生部分降解作用。为改善此情况，可尝试加入多种蛋白酶抑制剂。

②为降低杂蛋白与镍柱的亲和力，可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。

③若杂蛋白与目的蛋白结合，可在超声处理前加入适量的去垢剂（如1%-2% Tritonx-100），以消除此现象。

2. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

当使用镍柱时出现棕色，这主要是由于缓冲液中的 DTT 引起的。DTT 对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响。在碱性缓冲液条件下，镍离子会被 DTT 还原生成棕色的沉淀。因此，所有的镍柱生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与。一般来说，镍柱的耐受性小于 5mM DTT，推荐缓冲液中不要超过 2mM DTT。

3. 镍柱堵了怎么办？

①样品处理：在样品中可能存在细胞碎片或其他杂颗粒，这些杂质可能会导至柱子堵塞。因此，在将样品加载到柱子上之前，必须对样品进行高速离心处理，以确保只加载纯净的样品。

②加入蛋白酶抑制剂：如果在纯化上清液时发现蛋白变性，产生了絮状物，应立即加入1-2mM DTT，以避免变性导至的蛋白质聚集。加入DTT的操作应在冰浴中进行。如果加入DTT后问题仍未解决，可以进一步加入尿素以变性蛋白质，使其在变性环境下稳定。

③调整料液比：样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大或导至蛋白析出或变性。料液比在1/10-1/15之间较为适宜。

4. 纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？

在纯化过程中，如果蛋白出现浑浊，可能是由于蛋白处于不稳定的环境中或其本身不稳定所导至的。因此，需要检查缓冲体系是否正确以及环境是否低温。此外，为了提高蛋白的稳定性，可以在缓冲液中加入还原剂DTT。另一种解决方案是加入肌氨酸钠，这可以迅速使蛋白变性并消除浑浊现象。

5. 没能纯化到带 His 标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？

①超声功率问题：

超声功率过大可能导至蛋白炭化，而过小则可能使蛋白没有充分释放。

策略：尝试调整超声功率，并在超声处理前加入适量的溶菌酶。

②样品及结合缓冲液问题：

样品或结合缓冲液的pH值不正确，或缓冲液中的成分（如EDTA）可能影响蛋白的结合。

策略：检测样品和结合缓冲液的pH值以及成分，确保它们是正确的和适合的。

③组氨酸标签暴露问题：

如果组氨酸标签没有完全暴露，将影响蛋白与镍柱的结合。

策略：在变性条件下（如使用8M脲，6M盐酸胍，1%SDS），并加入1-2mMDTT进行纯化。

④His标签丢失问题：

His标签丢失可能是由于蛋白在纯化过程中发生了降解或脱落。

策略1：通过WB或anti-his抗体检查His标签是否存在，检查上游构建是否正确，并尝试改变His-tag的位置（C-terminal或N-terminal），必要时增加His标签的数量。

策略2：孵育时间不足可能导至蛋白未能充分结合。降低流速并增加孵育时间可能有助于提高蛋白的结合效率。

策略3：不同的金属离子可能对蛋白与镍柱的结合产生影响。尝试改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。例如，Ni2+通常是首选的金属离子用于从宿主细胞蛋白中纯化大多数组氨酸6标记的重组蛋白质。但是，有些蛋白可能更适合使用其他金属离子进行纯化而非Ni2+。可以通过Hitrap IMACHP来筛选不同的金属离子。

6. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决？

①洗脱条件太温和：

如果洗脱条件过于温和，可能导至组氨酸标记的蛋白质仍然与柱子结合，因为结合力较强。

策略：尝试增加咪唑的梯度洗脱，或者降低pH来找出最佳的洗脱条件。

②降低pH方法洗脱的问题：

如果使用降低pH的方法进行洗脱，但pH值过低可能会导至镍离子脱落。

策略：改变洗脱方法，使用咪唑竞争性洗脱。

③蛋白已沉淀在柱上的问题：

有时蛋白可能已经沉淀在柱上。

策略：减少上样量和孵育的时间，尝试使用去污剂（如1%-2% Tritonx-100）或改变NaCl的浓度。还可以在变性条件下进行洗脱（如使用8M脲或6M 盐酸胍），最终也可以在洗脱Buffer中加入2mMDTT或者0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

④非特异性疏水或其他相互反应的问题：

可能是由于非特异性疏水或其他相互反应导至蛋白挂在柱子上。

策略：在洗脱缓冲液中加入非离子去污剂（如2% Triton X-100）或者增加NaCl的浓度。

7. 如何处理样品，可使其初步提纯（如何洗去蛋白的自身带）？

（1）上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。

（2）去大肠杆菌自身带（两条 30KD-40KD）可用非变性缓冲液超声悬浮（加入去垢剂），离心 6000r/min,30min,10℃。（若效果不够可继续上述步骤）。

（3）大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可选取其中纯度最佳的。

（4）可用硫酸铵沉淀法，初步提纯。

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